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.2020年5月6日；28(5):1359-1372.
doi:10.1016/j.ymthe.2020.03.005。 Epub 2020年3月10日。

CRISPR/Cas9-介导的miR-29b编辑治疗小鼠不同类型的肌肉萎缩

金丽 1, 王丽君 1, 雪教花 1, 海飞汤 1, 陈锐（Rui Chen） 1, 杨婷婷 1, 索米亚·达斯 2, 肖俊杰 三
附属机构

CRISPR/Cas9-介导的miR-29b编辑治疗小鼠不同类型的肌肉萎缩

金丽等人。 分子治疗. .

摘要

肌肉萎缩是骨骼肌质量和力量的丧失，是对各种分解代谢刺激的反应。目前，除运动外，临床上没有有效的治疗方法可以减少肌肉萎缩。在这里，我们报告了通过向腓肠肌或胫骨前肌局部注射CRISPR/Cas9介导的基因组编辑有效地靶向miR-29b前体的生物生成处理位点。在体内，这种基于CRISPR的治疗通过激活AKT-FOXO3A-mTOR信号通路防止血管紧张素II（AngII）诱导的肌肉萎缩、制动和失神经，并防止AngII诱导的小鼠心肌细胞凋亡，从而显著提高运动能力。我们的工作建立了基于CRISPR/Cas9的miRNA基因靶向治疗肌肉萎缩的潜在持久疗法，并扩展了体内检测miRNA功能的可用策略。

关键词：AKT-FOXO3A-mTOR信号通路；CRISPR/Cas9；miR-29b；肌肉萎缩。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
CRISPR/Cas9通过肌内CRISPR给药介导miR-29b的突变（A）miR-29b前miRNA发夹结构图。（B） 分别用lentCRISPRv2、gRNA-miR-29b-A、gRNA-miR-29b-B、gRNC-miR-29b-C和gRNA-miR-29b-D治疗后，实时PCR分析C2C12肌管中miR-29b的表达（n=5、6、6、5）。（C） 利用转染Cas9和gRNAs的C2C12肌管基因组DNA在靶位点进行T7EI分析。箭头表示基因编辑后的预期带。（D） CRISPR介导（gRNA-miR-29b-D）基因编辑后C2C12肌管中成熟miR-29a、miR-29b和miR-29c表达的实时PCR分析（n=3）。（E） SpCRISPR-gRNA-miR-29b-D治疗小鼠与对照组（n=5）成熟miR-29a、miR-29b和miR-29c表达的实时PCR分析。CRISPRv2（lentCRISPRv 2）是一种没有gRNA盒的对照Cas9载体，gRNA-miR-29b-a、gRNA-miR-29b-B、gRNA-miR-29b-C和gRNA-miR-29b-D分别是CRISPR2，其中插入了gRNA-iR-29b-a、gRNA-miR-29b-B、gRNA-miR-29b-C和gRNC-miR-29b-D。两组（B、D和E）之间的比较使用了不成对的双尾Student t检验。*与相应对照组相比，p<0.05，**p<0.01。数据表示为平均值±SEM。另请参见图S1和S2。
图2
图2
CRISPR/Cas9-介导的miR-29b编辑预防血管紧张素II诱导的肌肉萎缩并维持小鼠运动能力在体内（A） 病毒注射时间表和AngII诱导的小鼠萎缩模型的建立。（B） RT-PCR分析经或未经SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的AngII治疗小鼠中成熟miR-29b的表达（n=4，5，6，6）。（C） 在接受或不接受SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的AngII治疗小鼠中，显示了腓肠肌形态（比例尺，1 cm）和腓肠肌重量/体重（GW/BW）比率（n=6，6，6和7）。（D） AngII处理小鼠中MuRF-1和Atrogin-1蛋白水平的Western印迹和定量分析，所述AngII处理小鼠具有或不具有SpCRISPR-gRNA-miR-29b处理（n=3）。对GAPDH蛋白和总蛋白进行染色以进行对照。（E） 经或未经SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的AngII治疗小鼠的典型WGA染色显微照片和肌纤维横截面积定量（n=5；比例尺，20μm）。（F） 经或未经SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的AngII治疗小鼠的典型H&E染色显微照片和腓肠肌肌纤维横截面积的量化（n=4；比例尺，50μm）。（G） 测量指定组（n=4，5，4，4）小鼠四肢的握力。控制；血管紧张素II。进行单因素方差分析（ANOVA）检验，比较多个组，然后进行基于方差齐性检验的Bonferroni或Dunnett T3事后检验。*与相应对照组相比，p<0.05，**p<0.01。数据表示为平均值±SEM。另请参见图S3和S4。
图3
图3
CRISPR/Cas9-介导的miR-29b编辑通过激活AKT-FOXO3A-mTOR信号通路（A）Western blot和定量分析腓肠肌提取物来检测经或未经SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的AngII治疗小鼠的IGF1和PI3K（p85α）蛋白水平，从而防止AngII诱导的萎缩效应（n=3）。对GAPDH蛋白和总蛋白进行染色以进行对照。（B） AKT（S473）、AKT（T308）、FOXO3A（S253）、FOXO3A（T32）、mTOR、P70S6K和EIF-4EBP1相对磷酸化水平的Western blot和定量分析（n=3）。控制；血管紧张素II。进行单因素方差分析（ANOVA）检验，比较多个组，然后进行基于方差齐性检验的Bonferroni或Dunnett T3事后检验。*与相应对照组相比，p<0.05，**p<0.01。数据表示为平均值±SEM。
图4
图4
CRISPR/Cas9-介导的miR-29b编辑预防固定化诱导的肌肉萎缩（A）病毒注射和固定化（Imo）诱导的小鼠萎缩模型的建立时间表。（B） 实时PCR分析固定化处理小鼠中成熟miR-29b的表达，包括SpCRISPR-miR-29b治疗和未治疗（n=5，4，4，5）。（C） 在有或无SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的制动处理小鼠中，显示了胫骨前肌形态（标尺，1 cm）和胫骨前重量/体重（TAW/BW）比率（n=6，10，6，9）。（D） Western blot和定量分析经或未经SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的制动处理小鼠的MuRF-1和Atrogin-1蛋白水平（n=3）。对GAPDH蛋白和总蛋白进行染色以进行对照。（E） 在接受或不接受SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的固定治疗小鼠中，代表性的WGA染色显微照片和肌纤维横截面积的定量（n=4，5，5，5；比例尺，20μm）。（F） 采用或不采用SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的制动处理小鼠胫骨前肌纤维的代表性H&E染色显微照片和横截面积定量（n=3,4,3,4；比例尺，50μm）。假手术；Imo，固定。进行单因素方差分析（ANOVA）检验，比较多个组，然后进行基于方差齐性检验的Bonferroni或Dunnett T3事后检验。*与相应对照组相比，p<0.05，**p<0.01。数据表示为平均值±SEM。另请参见图S5和S6。
图5
图5
CRISPR/Cas9-介导的miR-29b编辑预防失神经诱导的肌肉萎缩（A）病毒注射和失神经（Den）诱导的萎缩小鼠模型的建立时间表。（B） RT-PCR分析失神经处理小鼠在接受或不接受SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗（n=12,10,14,10）的情况下成熟miR-29b的表达。（C） 腓肠肌形态（比例尺，1cm）和GW/BW比率显示在接受或不接受SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的去神经治疗小鼠（n=6）中。（D） Western blot和定量分析经或未经SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的失神经小鼠中MuRF-1和Atrogin-1的蛋白质水平（n=3）。对GAPDH蛋白和总蛋白进行染色以进行对照。（E） 采用或不采用SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的失神经处理小鼠的典型WGA染色显微照片和肌纤维横截面积的量化（n=4；比例尺，100μm）。（F） 经或未经SpCRISPR-gRNA-miR-29b治疗的失神经小鼠腓肠肌肌纤维的代表性H&E染色显微照片和横截面积定量（n=4；标尺，50μm）。假手术，假手术。进行单因素方差分析（ANOVA）检验，比较多个组，然后进行基于方差齐性检验的Bonferroni或Dunnett T3事后检验。*与相应对照组相比，p<0.05，**p<0.01。数据表示为平均值±SEM。另请参见图S7和S8。
图6
图6
AAV8-CRISPR/SaCas9-介导的miR-29b编辑预防血管紧张素II诱导的肌肉萎缩在体内（A） AAV8-CRISPR/SaCas9-miR-29b与SaCas9的主干由骨骼肌细胞特异性dMCK启动子驱动。（B） AAV8病毒注射时间表和AngII诱导的小鼠萎缩模型的建立。（C） 使用或不使用AAV8-SaCRISPR-miR-29b的AngII治疗小鼠中成熟miR-29b表达的RT-PCR分析（n=6，5，8，5）。（D） 在注射或不注射AAV8-SaCRISPR-miR-29b的AngII治疗小鼠中显示了腓肠肌形态（比例尺，1 cm）和GW/BW比率（n=7，5，10，6）。（E） Western blot和定量分析经或未经AAV8-SaCRISPR-miR-29b治疗的AngII治疗小鼠的MuRF-1和Atrogin-1蛋白水平（n=3）。对GAPDH蛋白和总蛋白进行染色以进行对照。（F） 在接受或不接受AAV8-SaCRISPR-miR-29b治疗的AngII治疗小鼠中，代表性的WGA染色显微照片和肌纤维横截面积的定量（n=4；比例尺，50μm）。（G） 经或未经AAV8-SaCRISPR-miR-29b治疗的AngII治疗小鼠的典型H&E染色显微照片和腓肠肌肌纤维横截面积的量化（n=4；比例尺，100μm）。（H） 测量指定组（8、7、10、8）小鼠四肢的握力。AAV8-GFP-2a-Luci是一个带有dMCK启动子的控制载体，AAV8-SaCRISPR-miR-29b是AAV8/dMCK的启动子，其中插入了SaCas9和gRNA-miR-29b-D。进行单向方差分析比较多组，然后进行基于方差齐性检验的Bonferroni或Dunnett T3事后检验。*与相应对照组相比，p<0.05，**p<0.01。数据表示为平均值±SEM。另请参见图S9和S10。
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