An absence of lamin B1 in migrating neurons causes nuclear membrane ruptures and cell death

doi:10.1073/pnas.1917225116

.2019年12月17日；116(51):25870-25879.

doi:10.1073/pnas.1917225116。 Epub 2019年12月3日。

迁移神经元中缺少层粘连蛋白B1会导致核膜破裂和细胞死亡

附属公司

¹加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院医学系，加利福尼亚州90095。
²加利福尼亚州洛杉矶加利福尼亚大学戴维·格芬医学院加利福尼亚纳米系统研究所，加利福尼亚州90095。
^三加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院化学与生物化学系，加利福尼亚州90095。
⁴加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院儿科，加利福尼亚州90095。
⁵加利福尼亚大学洛杉矶分校儿童发现与创新研究所，加利福尼亚州90095。
⁶Eli和Edythe Broad再生医学和干细胞研究中心，加利福尼亚大学洛杉矶分校，邮编90095。
⁷加利福尼亚大学洛杉矶分校生物工程系，加利福尼亚州90095。
⁸加州大学洛杉矶分校材料科学与工程系，加利福尼亚州90095。
⁹加利福尼亚大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院医学系，加利福尼亚州90095；lfong@mednet.ucla.edu sgyoung@mednet.ucla.edu。
¹⁰加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院人类遗传学系，加利福尼亚州90095。
¹¹加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子生物学研究所，加利福尼亚州90095。

PMID： 31796586
PMCID公司： PMC6926041型
内政部： 10.1073/pnas.1917225116

迁移神经元中缺少层粘连蛋白B1会导致核膜破裂和细胞死亡

Natalie Y Chen（娜塔莉·Y·陈）等。美国国家科学院程序. 2019.

.2019年12月17日；116(51):25870-25879.

doi:10.1073/pnas.1917225116。 Epub 2019年12月3日。

附属公司

¹加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院医学系，加利福尼亚州90095。
²加利福尼亚州洛杉矶加利福尼亚大学戴维·格芬医学院加利福尼亚纳米系统研究所，加利福尼亚州90095。
^三加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院化学与生物化学系，加利福尼亚州90095。
⁴加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院儿科，加利福尼亚州90095。
⁵加利福尼亚大学洛杉矶分校儿童发现与创新研究所，加利福尼亚州90095。
⁶Eli和Edythe Broad再生医学和干细胞研究中心，加利福尼亚大学洛杉矶分校，加利福尼亚州90095。
⁷加利福尼亚大学洛杉矶分校生物工程系，加利福尼亚州90095。
⁸加州大学洛杉矶分校材料科学与工程系，加利福尼亚州90095。
⁹加利福尼亚大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院医学系，加利福尼亚州90095；lfong@mednet.ucla.edu sgyoung@mednet.ucla.edu。
¹⁰加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院人类遗传学系，加利福尼亚州90095。
¹¹加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子生物学研究所，加利福尼亚州90095。

PMID： 31796586
PMCID公司： PMC6926041型
内政部： 1997年10月10日/第17225116页

摘要

层粘连B1或层粘连B2的缺失会导致发育中大脑皮层神经元的迁移缺陷和神经元存活率降低。神经元迁移异常是由一个削弱的核膜干扰核分裂（神经元迁移所需的核移位过程）来解释的。相反，对神经元存活受损的解释却知之甚少。我们假设，神经元迁移过程中施加在细胞核上的力会导致核膜（NM）破裂，导致细胞核和细胞质内容物的散布，最终导致细胞死亡。为了验证这个假设，我们繁殖了最小1-表达核定位荧光的缺陷小鼠Cre公司记者。E18.5皮层板内的迁移神经元最小1-缺陷胚胎表现出NM破裂，电子显微镜下可见核定位报告子逃逸到细胞质和NM不连续。NM破裂伴有DNA损伤和细胞死亡。在心室区的非迁移细胞中未观察到NM破裂。培养基中也观察到NM破裂、DNA损伤和细胞死亡最小1^-/-和Lmnb2（磅2）^-/-神经元从神经球中迁移出来。为了测试细胞核上的机械力是否与迁移神经元的NM断裂有关，我们检测了培养的神经元最小1^-/-当神经元暴露于外部收缩力（迁移到紧密间隔的硅柱场中）时。当细胞进入柱子区域时，NM经常断裂，伴随着DNA损伤和细胞死亡。

关键词：B型层粘连蛋白；核膜；核层粘连蛋白；核膜破裂。

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作者声明没有竞争性利益。

数字

**图1。**
前脑特异性失活*最小1*导致小鼠胚胎大脑皮层的神经元细胞死亡，并导致NM破裂。(A类)E18.5对照组大脑皮层的免疫荧光显微镜(*最小1*^+/+)和*最小1*科(*Emx1-核心Lmnb1*^{飞行/飞行})程序性细胞死亡标记物（caspase3，绿色）染色后的胚胎。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，50μm）(B类)对照组大脑皮层和小脑的免疫荧光显微镜(*最小1*^+/+ *Lmnb2（磅2）*^{飞行/飞行})和*最小1*KO公司(*Emx1-核心Lmnb1*^{飞行/飞行})E18.5用LIVE/DEAD荧光活性染料染色组织后的胚胎。LIVE/DEAD染料在活细胞中产生绿色信号，在死细胞中产生红色信号。作为死亡细胞的阳性对照，用70%乙醇处理野生型小鼠胚胎大脑。（比例尺，100μm）(C类–E类)对照组皮层神经元的荧光显微镜图像(*最小1*^+/+ROSA公司^{nT nG})和*最小1*KO ROSA公司(*Emx1-核心Lmnb1*^{飞行/飞行}ROSA公司^{nT nG})E18.5胚胎。ROSA公司^{nT nG}在缺乏外源基因的情况下，转基因产生一个核靶向td番茄报告子*Cre公司*和核靶向GFPCre公司在这些图像中，tdTomato和GFP均为白色，DNA（DAPI染色）为青色。C类显示了一个对照胚胎和一个*最小1*KO ROSA胚胎；黄色箭头指向NM破裂的神经元（ROSA逃逸^{nT nG}进入细胞质的报告子）。（比例尺，5μm）(D类和E类)对照胚胎前脑皮质板（CP）和心室区（VZ）的图像(D类)和a最小1KO ROSA胚胎(E类). 在对照胚胎中，ROSA^{nT nG}报告者局限于CP和VZ神经元的细胞核内。许多CP神经元位于*最小1*KO ROSA胚胎出现NM破裂，报告蛋白逃逸到细胞质中（黄色箭头），但报告者仍局限于VZ神经元的细胞核。（标尺，50μm，除插图其中比例尺为10μm。）(F类和*G公司*)显示E18.5皮层板神经元NM不连续性的电子显微照片*最小1*KO公司(*Emx1-核心Lmnb1*^{飞行/飞行})胚胎（红色箭头）。（用于低倍图像的比例尺左侧，1μm；上图像的比例尺赖特，200纳米）N、细胞核；C、细胞质。

**图2。**
核层粘连蛋白在缺乏层粘连B1或层粘连B2的神经前体细胞中的表达。(A类)前层蛋白A、层蛋白C、层蛋白B1和层蛋白B2的转录水平*最小1*^+/+*Lmnb2（磅2）*^+/+（重量），*最小1*^−/−*Lmnb2（磅2）*^+/+（B1KO），以及*最小1*^+/+*Lmnb2（磅2）*^−/−（B2KO）未分化和分化神经元。包含的控件*Lmna公司*^+/+*最小1*^+/+*Lmnb2（磅2）*^+/+小鼠胚胎成纤维细胞（WT-MEFs）和*Lmna公司*^–/–MEF公司(*Lmna公司*KO）。表达水平标准化为*Ppia公司*; 条形图显示了两个独立实验的平均值，点表示单个实验的值。(B类和C类)抗层粘连蛋白A/C和B1抗体染色后的神经元免疫荧光显微镜观察(B类)或抗层粘连蛋白B2的抗体(C类). DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，25μm）(D类和E类)神经元蛋白提取物与抗层粘连蛋白A/C（绿色）和层粘连蛋白质B1（红色）抗体的蛋白质印迹(D类)或带有针对层粘连蛋白A/C（红色）和层粘连蛋白质B2（绿色）的抗体(E类). 肌动蛋白被用作加载控制。(F类)描绘WT、B1KO和B2KO神经元的核圆形度和核面积的条形图。对每个基因型的3个神经球中的200多个细胞进行了分析。平均值±SD**P（P）*<0.05由未成对学生t吨测试。

**图3。**
B1KO和B2KO神经元NM破裂。(A类)表达NLS-GFP的B1KO和B2KO神经元的活细胞荧光显微镜图像。红色箭头表示NM破裂（核定位GFP逃逸到细胞质中）。（比例尺，20μm）(B类)在连续50小时的成像过程中，5个独立实验中NM神经元破裂的百分比。该比率描述了NM破裂的数量相对于观察到的细胞总数****P（P）*< 0.0001. (C类)5个独立实验中NM破裂事件的数量，每个实验都有50小时的成像。平均值±SD**P（P）*< 0.01. ***P（P）*< 0.001. 5个实验中有一个是异常值，NM破裂次数是其他4个实验的2-3倍。排除异常值实验时(*SI附录*，图S6)，SD较小，统计置信水平较高。(D类)NM破裂的平均持续时间†在B2KO神经元中从未观察到NM破裂的修复；因此，38.8小时的持续时间代表了在50小时成像期间观察到NM破裂的平均时间长度。(E类)成像50小时内死亡的NM破裂细胞百分比。该比率描述了死亡的NM破裂细胞数相对于NM破裂细胞总数的关系。†25个B2KO神经元中有17个出现NM断裂，细胞死亡；在50小时成像期结束时，25个NM破裂的细胞中有8个仍然存活，没有NM修复的证据。B类–E类显示平均值±SD***P（P）*< 0.001.

**图4。**
培养的B1KO和B2KO神经元的细胞死亡。(A类)WT的荧光显微镜(*最小1*^+/+ *Lmnb2（磅2）*^{飞行/飞行})用LIVE/DEAD活性染料染色后的B1KO和B2KO神经元。LIVE/DEAD染料在活细胞中发出绿色荧光，在死细胞中发出红色荧光。作为死亡细胞的对照，我们用70%乙醇处理野生型神经元。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，20μm）(B类)WT、B1KO和B2KO神经元在Matrigel中培养7 d并用程序性细胞死亡抗体标记物（caspase 3，绿色）染色的免疫荧光显微镜。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，25μm）下部显示胱天蛋白酶3在白色背景下呈黑色染色。(C类)WT、B1KO和B2KO分化神经元的免疫荧光显微镜，这些神经元已培养30天，然后用DNA损伤标记物γH2AX（红色）抗体染色。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，50μm）赖特caspase 3染色为白色背景下的黑色。

**图5。**
层粘连蛋白B2的过度表达可减少B1KO和B2KO神经元的细胞死亡和NM破裂。(A类)WT、B1KO和B2KO神经元提取物的蛋白质印迹；用强力霉素诱导的层粘连蛋白B2慢病毒载体（pTRIPZ）转导神经元-*LMNB2型*)然后在Dox存在或不存在的情况下孵化。肌动蛋白被用作负载对照。条形图显示了归一化为肌动蛋白的层粘连蛋白B2的水平。(B类)pTRIPZ转导的WT、B1KO和B2KO神经元的免疫荧光显微镜-*LMNB2型*在Dox存在下，细胞表达层粘连蛋白B2。用抗层粘连蛋白B2（红色）和LAP2β（绿色）抗体染色神经元后，进行免疫荧光显微镜检查。（比例尺，20μm）(C类)在活体细胞成像的20小时内，B1KO和B2KO神经元出现NM破裂的百分比。比率显示NM破裂的神经元数量与检查的神经元总数之比。(D类)NM破裂事件总数与检测的神经元总数相关。在这些研究中，神经元被NLS-GFP和pTRIPZ转导-*LMNB2型*在Dox存在或不存在的情况下孵化。荧光显微镜观察NM破裂（NLS-GFP在细胞质中逸出）。数据显示了两个独立实验的总数。(E类)通过LIVE/DEAD荧光活性染料染色判断，B1KO和B2KO神经元中的层粘连蛋白B2过度表达可减少细胞死亡。用pTRIPZ转导的WT、B1KO和B2KO神经元-*LMNB2型*在Dox存在或不存在的情况下培养24小时，然后用LIVE/DEAD染料培养，该染料在活细胞中发出绿色荧光，在死细胞中发出红色荧光。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，50μm）(F类)根据半胱天冬酶3染色判断，B1KO和B2KO神经元中层粘连蛋白B2的过度表达可减少程序性细胞死亡。用pTRIPZ转导的WT、B1KO和B2KO神经元-*LMNB2型*在Dox存在或不存在的情况下孵育24小时，然后用caspase 3特异性抗体（绿色）染色。WT细胞未发现caspase 3染色。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，50μm）下部显示白底黑底caspase 3染色。

**图6。**
在B1KO神经元迁移到硅柱场（直径8μm；高度22μm；间隔4μm）的过程中，NM破裂和细胞死亡。(A类,左侧)硅片的扫描电子显微照片（一侧平坦，另一侧以均匀间隔的硅柱为图案）。（比例尺，30μm）(A类,中部和赖特)均匀间隔硅柱的扫描电子显微照片。（比例尺，2μm）(B类)NLS-GFP表达的WT和B1KO神经元在细胞迁移到柱子区域后的活细胞荧光显微镜图像（间隔20分钟）。在B1KO神经元中观察到NM破裂（NLS-GFP逃逸到细胞质中）（红色箭头；底部)但WT神经元中没有(顶部). （比例尺，20μm）(C类)使用caspase 3特异性抗体（凋亡细胞死亡的标志物）对WT和B1KO神经元进行免疫荧光显微镜检查。神经球被移液到硅片的光滑部分，单个神经元被允许迁移到柱子的区域。神经元迁移到柱状区使细胞和细胞核受到收缩力的作用。在B1KO神经元（而非WT神经元）迁移到柱子区域后，通过caspase 3染色判断细胞死亡。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，50μm）下面的面板显示caspase 3在白色背景下呈黑色染色。柱子区域的边缘用黄色虚线标记。(D类)使用LIVE/DEAD荧光活性染料进行荧光显微镜检查，发现B1KO神经元（但不包括WT神经元）中的细胞在迁移到柱子区域后死亡。LIVE/DEAD荧光活性染料在活细胞中发出绿色荧光，在死细胞中发出红色荧光。（比例尺，50μm）

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1. Vergnes L.、Péterfy M.、Bergo M.O.、Young S.G.、Reue K.、Lamin B1是小鼠发育和核完整性所必需的。程序。国家。阿卡德。科学。《美国法典》第101卷，第10428–10433页（2004年）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Moir R.D.、Montag-Lowy M.、Goldman R.D.，核层粘连的动力学特性：层粘连蛋白B与DNA复制位点相关。《细胞生物学杂志》。125, 1201–1212 (1994).-项目管理咨询公司-公共医学
1. Lopez-Soler R.I.、Moir R.D.、Span T.P.、Stick R.、Goldman R.D.，核层粘连在核膜组装中的作用。《细胞生物学杂志》。154, 61–70 (2001).-项目管理咨询公司-公共医学
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[5] Moir R.D.、Montag-Lowy M.、Goldman R.D.，核层粘连的动力学特性：层粘连蛋白B与DNA复制位点相关。《细胞生物学杂志》。125, 1201–1212 (1994).-项目管理咨询公司-公共医学

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[7] Lopez-Soler R.I.、Moir R.D.、Span T.P.、Stick R.、Goldman R.D.，核层粘连在核膜组装中的作用。《细胞生物学杂志》。154, 61–70 (2001).-项目管理咨询公司-公共医学

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