MRE11-RAD50-NBS1 promotes Fanconi Anemia R-loop suppression at transcription-replication conflicts

doi:10.1038/s41467-019-12271-w

.2019年9月19日；10(1):4265.

doi:10.1038/s41467-019-12271-w。

MRE11-RAD50-NBS1在转录-复制冲突中促进范科尼贫血R-loop抑制

附属公司

¹加拿大温哥华市不列颠哥伦比亚省癌症中心Terry Fox实验室，V5Z 1L3。
²加拿大温哥华不列颠哥伦比亚省儿童医院研究所分子医学和治疗中心，V5Z 4H4。
^三魁北克大学肿瘤中心，魁北克市，G1R 2J6，加拿大。
⁴加拿大魁北克市G1V 0A6拉瓦尔大学癌症研究中心分子生物学、医学生物化学和病理学系。
⁵麻省理工大学博德学院和哈佛大学，马萨诸塞州剑桥，02142，美国。
⁶加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学迈克尔·史密斯实验室，V6T 1Z4。
⁷加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学医学遗传学系，V5Z 4H4。
⁸加拿大温哥华市不列颠哥伦比亚省癌症中心Terry Fox实验室，V5Z 1L3。pstirling@bccrc.ca。
⁹加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学医学遗传学系，V5Z 4H4。pstirling@bccrc.ca。

PMID： 31537797
预防性维修识别码： PMC6753070型
内政部： 10.1038/s41467-019-12271-w

MRE11-RAD50-NBS1在转录-复制冲突中促进范科尼贫血R-loop抑制

艾米丽·尹-张驰（Emily Yun-Chia Chang）等。国家公社. 2019.

.2019年9月19日；10(1):4265.

doi:10.1038/s41467-019-12271-w。

附属公司

¹加拿大温哥华市不列颠哥伦比亚省癌症实验室，V5Z 1L3。
²加拿大温哥华不列颠哥伦比亚省儿童医院研究所分子医学和治疗中心，V5Z 4H4。
^三魁北克大学肿瘤中心，魁北克市，G1R 2J6，加拿大。
⁴加拿大魁北克市G1V 0A6拉瓦尔大学癌症研究中心分子生物学、医学生物化学和病理学系。
⁵麻省理工大学博德学院和哈佛大学，马萨诸塞州剑桥，02142，美国。
⁶加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学迈克尔·史密斯实验室，V6T 1Z4。
⁷加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学医学遗传学系，V5Z 4H4。
⁸加拿大温哥华市不列颠哥伦比亚省癌症中心Terry Fox实验室，V5Z 1L3。pstirling@bccrc.ca。
⁹加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学医学遗传学系，V5Z 4H4。pstirling@bccrc.ca。

PMID： 31537797
预防性维修识别码： PMC6753070型
内政部： 10.1038/s41467-019-12271-w

摘要

异位R-loop积累导致DNA复制应激和基因组不稳定。为了避免这些结果，细胞具有一系列抗R-loop机制，包括降解R-loop中RNA部分的RNaseH。为了全面确定抗R-loop机制，我们对缺乏RNH1和RNH201的酵母进行了全基因组三核苷酸相互作用筛选。我们确定了100多个在缺乏RNaseH的情况下对适应性至关重要的基因，这些基因被富集用于DNA复制叉维持因子，包括MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物。虽然MRN已被证明在DNA双链断裂时促进R环，但我们发现它在转录-复制冲突时抑制R环和相关DNA损伤。这是通过MRE11的非核溶解功能发生的，该功能对范科尼贫血途径的R环抑制很重要。这项工作为MRE11-RAD50-NBS1在转录-复制冲突中指导耐受机制方面建立了新的作用。

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图1
RNaseH缺乏酵母依赖于复制体功能和叉子保护来适应环境。一双突变和三突变SGA筛选与指定查询基因型的负遗传互作结果。图中显示了候选负基因相互作用的维恩图（左图），三重突变体位于蓝色圆圈中时，验证的命中率更高。b条阴性的基因本体分析纳赫ΔΔ-相互作用的合作伙伴。图中显示了ReviGO的输出，它有效地修剪了多余的GO术语。**c（c）**S9.6染色显示染色体在所示菌株中扩散。虚线之间的菌株染色细胞核的比例明显高于WT（Fisher精确检验）。第页 < 0.05，Holm–Bonferroni修正）。红点表示预测阳性对照（见正文）。方框图显示最小值和最大值，线条位于平均值。d日DNA的验证：RNA杂交增加*拉德50*Δ单元。负号和正号表示细胞生长时没有或带有RNH1过表达质粒。**e（电子）**和**（f）**平均全基因组相对DNA：WT中RNA杂交占有率，以及*拉德50*Δ是基因长度的函数。生成了重复的配置文件。这里显示了分位数归一化数据和平均数据。**e（电子）**色差图显示了WT中DNA:RNA杂交水平的热图，以及*雷达50*Δ.（f）共有4868个基因被分为指定的基因长度类别（538个基因<750 bp，1861个基因<1500 bp，1263个基因<2250 bp，636个基因<3000 bp，570个基因≤3000 bp），计算并绘制了每个类别的平均富集分数

图2
保留MRN耗尽的人类细胞中RNaseH依赖性和R-loop积累。一RNaseH2A正常和敲除细胞的细胞活力耗尽*RAD50型*,*MRE11，*或*国家统计局1*用结晶紫染色法测量(N个 = 4; *对 < 0.05乘以t吨测试；平均值±SEM）显示，在耗尽*RAD50型*和*国家统计局1*.b条MRN复合物缺失细胞中每个核的相对S9.6染色强度。N个 = 3; ****对 < 方差分析为0.0001；平均值±标准偏差。**c（c）**经si-Cont或si-RAD50处理的HeLa细胞中每个细胞核S9.6染色的代表性图像（左）和量化（右）。用对照载体（GFP）或表达GFP-RNaseH1（GFP-RNH1）的载体转染细胞。N个==================================================================3; ****对 < 0.0001依据t吨测试；平均值±标准偏差。d日沉淀前用DRIP-qPCR分析对照细胞和si-RAD50细胞中BTBD和TFPT基因座的R-loop积累，包括RNaseH处理和不处理。N个 = 3*对 < 0.05乘以t吨测试；平均值±SEM。**e（电子）**和**（f）**γ-H2AX染色和中性彗星DNA断裂试验显示RAD50缺失细胞中依赖RNaseH1的DNA损伤表型。**e（电子）**γ-H2AX染色(N个 = 4; ****对 < 通过费希尔精确试验得出0.0001；平均值±SD）和**（f）**中性彗星试验(N个 = 3; ***对 < 0.001和****对 < 0.0001依据t吨测试；平均值±SEM）。对于**c（c）**–**（f）**以及后续图（3b、4a、5a和6）中的一些面板，R回路的卡通示意图说明了实验测试的效果

图3
RAD50对复制依赖型和溃溃诱导型R-回路的相反影响。一DNA损伤-信号激活。针对所示表位的代表性免疫印迹显示在每个面板下方并进行量化。b条R环依赖性ssDNA暴露的天然BrdU染色。代表性图像（左）和核荧光定量显示（右）。N个 = 4; ****方差分析显示P<0.0001；平均值±标准偏差。**c（c）**电离辐射引起的损伤和R环。左侧面板显示γH2AX染色，以确认辐照造成的损伤。图（右）显示了S9.6染色强度的量化。N个 = 3****对 < 方差分析为0.0001；平均值±标准偏差。d日DNA：HU诱导叉子失速或断裂期间RNA杂交积累。低剂量HU（2 m米)诱导失速，而高剂量HU（4 mM）诱导断裂。N个==========================================================================3; **对 < 0.01和****对 < 方差分析为0.0001；平均值±SD

图4
转录-复制冲突损害MRN缺失细胞的分叉进展。一RAD50对转录-复制的调控冲突。以复制体（抗PCNA）和RNA聚合酶II（抗RNA Pol II）为靶点的近接连接试验显示了代表性图像（左）和量化图像（右）。N个 = 3; ****对 < 0.0001依据t吨测试；平均值±SEM。b条RAD50缺失细胞中的转录依赖性复制体减慢。用50μ米IdU标记前，虫草素（CORD）持续2小时。**c（c）**RAD50缺失细胞中的R环依赖性复制体减慢。对于b条和**c（c）**图中显示了实验方案（左）、指示条件下的代表性DNA纤维（中）和量化的CldU轨迹长度（右）。N个 = 3; ****对 < 0.0001依据t吨测试；平均值±标准偏差。d日和**e（电子）**复制应激期间Mre11与EdU标记的新生DNA结合的SIRF分析。PlaB或HU治疗促进Mre11向forks的招募。在PlaB处理的细胞中，这种招募依赖于R环。代表性图片(d日)、和量化(**e（电子）**)如图所示。N个 = 3用于控制和PlaB，N个 = HU为2****对 < 方差分析为0.0001；平均值±SD

图5
MRN复合体在减轻R环相关DNA损伤中的结构作用。一MRE11抑制剂Mirin（50μ米)如图所示。N个 = 三；t吨测试；平均值±标准偏差。显示了在R环上测试MRE11核酸酶活性的目标示意图。b条用EtOH（对照）或4-OHT治疗以诱导基因敲除后，指示基因型的TK6衍生淋巴母细胞的平均S9.6荧光强度。代表性的FACS直方图如下所示，曲线颜色对应于条形图。N个 = 3; ***对 < 方差分析为0.001；平均值±SEM。**c（c）**dsDNA和DNA的头对头比较：通过纯化的MRN复合体在60-mer双工体上进行RNA杂交切除。输入分子的浓度依赖性降解如右图所示

图6
MRN在范科尼贫血途径中发挥作用，将FA蛋白招募到R环。一和b条在指定条件下，对核S9.6染色强度的上位效应。水瓶座（AQR）是一种不同途径中的剪接解旋酶和R-loop调节因子，AQR缺失显示随着si-FANCD2的增加，核S9.6染色增加一.N个 = 3; ****对 < 方差分析为0.0001；平均值±标准偏差。**c（c）**在指定的细胞条件下，通过免疫荧光对核FANCD2病灶进行定量。进行了三次重复实验，并通过Fisher精确检验和Bonferroni校正对聚集病灶数进行了比较第页使用了值截止值*对 < 0.05和**对 < 0.01.d日和**e（电子）**R-loop倾向位点BTBD和TFPT的FANCM和BLM的ChIP取决于RAD50。N个 = 3; *对 < 0.05和**对 < 0.01由t吨测试；平均值±SEM。说明MRN-FA途径的卡通一,b条RAD50对FANCM/BLM招募的积极影响显示在每个面板旁边

图7
R回路容差和缓解中的MRN功能模型。一MRN复合物可能在FA途径激活和基因组稳定性维持上游的转录-复制冲突中发挥结构作用。FA途径如何解决这些冲突的推测模型用问号表示。b条当MRN耗尽时，FA蛋白在转录中的招募不足——复制冲突，R环稳定，DNA受损，导致基因组不稳定

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