Lack of activity of recombinant HIF prolyl hydroxylases (PHDs) on reported non-HIF substrates

doi:10.7554/eLife.46490

.2019年9月10日8:e46490。

doi:10.7554/eLife.46490。

重组HIF脯氨酰羟化酶（PHD）在已报道的非HIF底物上缺乏活性

附属公司

¹弗朗西斯·克里克研究所，英国伦敦。
²英国牛津大学化学系化学研究实验室。
^三英国牛津大学努菲尔德临床医学系路德维希癌症研究所。
⁴目标发现研究所，英国牛津大学纳菲尔德临床医学系。
⁵芬兰欧陆大学生物中心欧陆分校细胞基质研究中心和生物化学与分子医学系。

^#贡献均等。

PMID： 31500697
预防性维修识别码： PMC6739866型
内政部： 10.7554/eLife.46490

重组HIF脯氨酰羟化酶（PHD）在已报道的非HIF底物上缺乏活性

马修·考克曼等。埃利夫. 2019.

.2019年9月10:8:e46490。

doi:10.7554/eLife.46490。

附属公司

¹弗朗西斯·克里克研究所，英国伦敦。
²英国牛津大学化学系化学研究实验室。
^三英国牛津大学努菲尔德临床医学系路德维希癌症研究所。
⁴目标发现研究所，英国牛津大学纳菲尔德临床医学系。
⁵芬兰欧陆大学生物中心欧陆分校细胞基质研究中心和生物化学与分子医学系。

^#贡献均等。

PMID： 31500697
预防性维修识别码： PMC6739866型
内政部： 10.7554/eLife.46490

摘要

人类和其他动物细胞通过催化转录因子HIF的氧调节脯氨酰羟基化，部署三种密切相关的加氧酶（PHD1、2和3）来指示氧水平。HIF脯氨酰羟化酶（PHD）酶作为氧传感器的发现提出了一个关键问题，即非HIF底物的存在和性质，可能会传递其他缺氧生物反应。据报道，有超过20种这种底物。因此，我们试图表征其与重组PHD酶的反应性。出乎意料的是，在支持HIF-α羟基化的条件下，我们没有检测到任何报告的非HIF蛋白或肽的脯氨酰羟化酶活性。我们不能排除PHD催化的脯氨酰羟基化在我们所检查的条件以外的条件下发生。然而，我们使用重组酶的研究结果并不能支持已报道的广泛的非HIF PHD底物。

关键词：生物化学；化学生物学；人；羟基化；加氧酶；脯氨酰羟化酶。

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利益冲突声明

MC、KL、YT、HP、WF、MA、RH、RF未宣布竞争性权益，JM持有FibroGen Inc、CS的股权，公关科学联合创始人和ReOx的股权持有人

数字

图1。 — **图1.肽羟基化的测定。**
来自HIF-1α（左）和选定的非HIF肽基底物的肽的LC-MS光谱（完整数据集参见图1-图补充1）与指示的PHD亚型或无PHD酶反应（对照）。在控制反应中，双电荷（M+2H⁺)肽显示出计算出的质量。与PHD孵育后，只有双电荷HIF-1α肽质量以7.997 Da（m+O+2H）的m/z增量移动⁺)表明脯氨酰羟基化。在任何非HIF基质上均未观察到PHD依赖性质量位移。

图1——图补充1。 — **图1-补充图1：肽羟基化的测定。**
来自HIF-1α（左）和非HIF肽基底物的肽与指示的PHD亚型或无PHD酶（对照）反应的LC-MS光谱。在对照反应中，带电肽（单个：M+H⁺; 双倍：M+2H⁺; 三重：M+3H⁺)显示计算的质量。与PHD孵育后，双电荷HIF-1α肽质量以7.997 Da（m+O+2H）的m/z增量移动⁺)表明脯氨酰羟基化。在任何非HIF基质上均未观察到PHD依赖性质量位移。

图2。 — **图2 IVTT产生的全长HIF底物上PHD酶的活性。**
HIF底物（HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α）由IVTT产生，并在没有（对照）或存在所示重组PHD酶的情况下反应。IVTT裂解液中的内源性PHD活性导致基础（对照）羟化水平，在添加重组PHD后显著增加。数据汇总为堆叠条形图，按目标位置分组，并报告LC-MSMS测定的脯氨酰羟基化水平（%）。关键：Pro（未氧化脯氨酸，黄色），Hyp（羟基脯氨酸，绿松石）。每个羟基化反应对应的提取离子色谱图作为图2补充图1 HIF-1αP402的以下补充；图2-图补充2，HIF-1αP564；图2——补充图3，HIF-2αP405；图2-图补充4，HIF-2αP531；图2——图补充5，HIF-3αP492*检测改良HIF-1α序列（M561A，M568A）。

**图2-图补充1。缺氧诱导因子1α中P402位点PHD催化羟基化的定量。**
IVTT产生的全长HIF-1α蛋白在没有（对照）或存在指示（PHD）酶的情况下培养，并用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶蛋白水解的半特异性HIF-1α*肽产物（即在Lys或Arg的C末端侧裂解的肽，但在另一端未裂解）用于P402羟基化的定量，因为MS未有效检测到特异性51肽。数据显示为m/z 1005.0619和m/z 1013.0593的提取离子色谱图，对应于对照或PHD反应条件下半特异性HIF-1α*（392-411）胰蛋白酶肽的未氧化（黄色）和P402ox（绿松石色）形式。观察到的物种的定量数据如色谱图上方的饼图所示。缺乏支持性MSMS的物种通过精确的质量和保留时间相似性进行分配。对于PHD1，未检测到未氧化离子（m/z 1005.0619；RT~71 min），因此标称羟化水平为100%。对于PHD3，P402ox物种的色谱洗脱部分与一个无关的双电荷离子重叠（m/z 1012.5482；RT 69.54；MSMS指定为角蛋白，扫描23441），其同位素包络（即m+1峰）与单同位素P402x物种的m/z无法区分。P402ox面积积分（绿松石）排除了这种污染物，但可能低估了峰面积。分配和量化数据如下表所示，标题如下：（−10lgP）给定保留时间（RT）下领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）*检测改良HIF-1α序列（M561A，M568A）。

图2——图补充2。 — **图2-补充图2。缺氧诱导因子1α中P564位点PHD催化羟基化的定量。**
IVTT产生的全长HIF-1α蛋白在没有（对照）或存在指示（PHD）酶的情况下培养，并用胰蛋白酶消化。为了便于P564ox的定量，使用了HIF-1α的变体，其中两个靠近脯氨酰羟基化位点且易于非酶催化氧化的蛋氨酸残基被丙氨酸取代（HIF-1 a*：M561A，M568A）。HIF-1α的这种修饰形式更适合于基于LC-MS的定量分析（甲硫氨酸氧化不会导致峰强度降低），并且对PHD依赖性催化的速率没有明显影响（Tian等人，2011）。P564ox的相对定量表示为m/z 1590.7540和1598.7515的XIC，对应于HIF-1α*（548-575）的未氧化（黄色）和P564x（绿松石）形式。观察到的物种的定量数据如色谱图上方的饼图所示。赋值和量化数据如下表所示，标题如下：给定（RT）下领先赋值的显著性得分（−10lgP），PTM定位的模糊性得分（AScore），以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。

图2——补充图3。 — **图2-补充图3。缺氧诱导因子2α中P405位点PHD催化羟基化的定量。**
IVTT产生的全长HIF-2α蛋白在没有（对照）或存在指示（PHD）酶的情况下培养，并用胰蛋白酶消化。P405ox的相对定量表示为m/z 1336.6514和1341.9830的XIC，对应于未氧化（黄色）和P405ox（绿松石色）形式的HIF-2α（393-429）。观察到的物种的定量数据如色谱图上方的饼图所示。分配和定量数据如下表所示，标题如下：（−10lgP）给定分配的显著性得分（RT），PTM定位的模糊性得分（AScore），并参考补充文件1中的主要MSMS数据。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT-Win.），表示为相对丰度（RA）。

图2——图补充4。 — **图2-补充图4。缺氧诱导因子2α中P531位点PHD催化羟基化的定量。**
IVTT产生的全长HIF-2α蛋白在没有（对照）或存在指示（PHD）酶的情况下培养，并用胰蛋白酶消化。P531ox的相对定量表示为m/z 1491.9943、1497.3259和1502.6576的XIC，对应于未氧化（黄色）、单氧化[P531x（绿松石色）、M535x（橙色）]和双氧化P531o；HIF-2α（513-550）的M535ox（紫色）形式。串联质谱分配的物种在肽水平（−10lgP）上被安全分配，但氧化位点的片段离子覆盖率低，阻止了修饰位点的自信分配（AScore:0或NL，未定位）。然而，在具有代表性的MSMS光谱中观察到诊断性片段离子，这意味着在P531（P531:+16）†或M535（M535:+16）⁄处氧化，分别对应于约77.8分钟和约77.5分钟洗脱的离散峰（见补充文件1中的支持MSMS）。与PHD酶孵育后，对应于P531ox而非M535ox的峰值增加。缺乏支持性MSMS的物种通过精确的质量和保留时间相似性进行分配。观察到的物种的定量数据如色谱图上方的饼图所示。赋值和量化数据如下表所示，标题如下：给定（RT）下领先赋值的显著性得分（−10lgP），PTM定位的模糊性得分（AScore），以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。总P531ox是脯氨酰与含羟基脯氨酸离子的聚合比率。

图2——补充图5。 — **图2-补充图5。缺氧诱导因子3α中P492位点PHD催化羟基化的定量。**
IVTT产生的全长HIF-3α蛋白在没有（对照）或有指示（PHD）酶的情况下培养，并用天冬氨酸-N消化。P492ox的相对定量表示为m/z 641.8065、649.8040、657.8014和665.7989的XIC，对应于HIF-3β的未氧化和多重氧化形式（486-496）含有两个容易氧化的Met残基（M489和M496）的肽。缺乏支持性MSMS的物种通过精确的质量和保留时间相似性进行分配。MSMS指定的物种有颜色（见插图）。注意，与重组PHD酶孵育后，含有P492ox的物种[（P492 ox，绿松石），（M489 ox；P492 oxs，粉色），（P492 x；M496 ox，紫色），（P489 oxs；P492 x，蓝色）]的相对增加。观察到的物种的定量数据如色谱图上方的饼图所示。赋值和量化数据如下表所示，标题如下：给定（RT）下领先赋值的显著性得分（−10lgP），PTM定位的模糊性得分（AScore），以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。总P492ox是脯氨酰与含羟基脯氨酰基离子的聚合比率。

图3。 — **图3：通过提取离子色谱（XIC）定量IVTT底物上与PHD酶反应的肽氧化的示例。**
(A类)显示了未氧化和P25ox形式的胰蛋白酶MAPK6（20-45）肽的等摩尔合成肽标准品的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种（包括非酶氧化）是有色的（见插图）；垂直虚线定义了峰值最大值，用于推导关键氧化离子的ΔRT值。 (B类)显示了在对照（左）或PHD3反应（右）条件下蛋白酶消化的IVTT底物的可比XIC数据。对应于MAPK6（20–45）的未氧化和M21ox形式的峰由MSMS指定（颜色代码见插图）；未检测到P25ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，由垂直虚线表示，应用于ERT P25ox的阴影对应于1分钟RT窗口。还显示了与氧化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和定量数据如下所示：（-10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore），以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺⁴)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽检测效率的数据（面板A，P:Hyp）是脯氨酰（P）和羟基脯氨酰基（Hyp）物种的聚合比率。

图3——图补充1。 — **图3补充图1。全长乙酰辅酶A羧化酶2与重组PHD3反应后ACACB（341-366）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了ACACB（341-366）肽的未氧化形式和P343ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P343ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化ACACB（341-366）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P343ox。P343ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。还显示了与氧化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺⁴)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽检测效率的数据（面板A，P:Hyp）是脯氨酰（P）和羟基脯氨酰基（Hyp）物种的聚合比率。

图3——图补充2。 — **图3-图补充2.全长乙酰辅酶A羧化酶2与重组PHD3反应后ACACB（436-454）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了ACACB（436-454）肽的未氧化形式和P450ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括从头甲硫氨酸氧化（M452ox；绿松石）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P450ox和M452ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于ACACB（436-454）的未氧化和丰富M452ox形式的峰；未检测到P450ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用虚线垂直表示，并显示IVTT衍生的M452ox在ERT洗脱；应用于ERT P450ox的阴影对应于1分钟RT窗口。还显示了与氧化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽检测效率的数据（面板A，P:Hyp）是脯氨酰（P）和羟基脯氨酰基（Hyp）物种的聚合比率。

图3——补充图3。 — **图3补充图3。全长β-肌动蛋白与重组PHD3反应后ACTB（292-312）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了ACTB（292-312）肽的未氧化和P307ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括非酶蛋氨酸氧化（M305ox；绿松石）；垂直虚线定义用于导出M305ox和P307oxΔRT值的峰值最大值。注意，相对于未氧化肽（浅棕色），P307ox（棕色）的比较离子计数高出4倍。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于ACTB（292-312）的未氧化型和M305ox型的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P307ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，由垂直虚线表示，应用于ERT P307ox的阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽的检测效率的数据（图A，P:Hyp）是脯氨酸（P）与含羟丙基（Hyp）的物质的聚集比率。

图3——图补充4。 — **图3补充图4。全长β-肌动蛋白与重组PHD3反应后ACTB（316-326）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示在(A类)显示了ACTB（316-326）肽的未氧化形式和P322ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括非酶蛋氨酸氧化（M325ox；绿松石）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P322ox和M325ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了ACTB（316-326）的未氧化和M325ox形式对应的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P322ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用垂直虚线表示，并显示IVTT衍生的M325ox洗脱靠近ERT；应用于ERT P307ox的阴影对应于1分钟RT窗口。还显示了与氧化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图5。 — **图3补充图5。全长β-2肾上腺素能受体与重组PHD3反应后ADRB2（376–404）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了ADRB2（376–404）肽的未氧化和脯氨酸氧化形式（P382ox、P395ox或组合）的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于导出不同含羟脯氨酸肽的ΔRT值。注意，与未氧化肽和单氧化肽相比，双氧化肽（紫色）的比较离子计数高出3倍。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化离子和ADRB2（376–404）的两种离散低化学计量比D380ox形式的峰（用蓝色箭头表示）；未检测到脯氨酰羟基化。脯氨酸氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用垂直虚线表示；阴影对应于1分钟RT窗口。显示了与单一（+16 Da）氧化事件兼容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）；在整个洗脱窗口中未观察到具有双重氧化（即+32 Da）兼容质量过量电荷的未分配离子。观测物种的定量数据以饼图形式与XIC数据一起呈现。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观察质量的离子计数（面积）（MH⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽的检测效率的数据（图A，P:Hyp）是脯氨酸（P）与含羟丙基（Hyp）的物质的聚集比率。

图3——补充图6。 — **图3补充图6。全长AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1与重组PHD2反应后AKT1（122–140）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了AKT1（122–140）肽的未氧化形式和P125ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括低丰度非酶蛋氨酸氧化（M134ox；绿松石）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P125ox和M134ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。对应于AKT1（122–140）的未氧化型和M134ox型的峰值由MSMS指定；未检测到P125ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，由虚线垂直线表示，并显示IVTT衍生M134ox在ERT附近洗脱；应用于ERT P125ox的阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图7。 — **图3补充图7。全长AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1与重组PHD2反应后AKT1（308-328）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了AKT1（308-328）肽的未氧化和脯氨酸氧化形式（P313ox、P318ox或组合）的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于导出不同含羟脯氨酸肽的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。在对照和酶反应条件下均检测到对应于未氧化AKT1（308-328）的峰值。在PHD2-反应制剂（蓝色箭头）中检测到AKT1的氧化形式（308–328），并且名义上定位于酪氨酸315（赋值不明确，AScore 0；MSMS见补充文件1 A-277）。对照数据中也观察到这种低丰度氧化离子的洗脱曲线与含羟脯氨酸肽的预期保留时间（ERT）不同（用虚线表示；阴影对应于1分钟RT窗口）。在整个洗脱窗口中没有观察到具有与氧化相容的质量过电荷的未分配离子（包括+16Da和+32Da物种）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和定量数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：给定（RT）下领先分配的显著性得分（−10lgP），PTM定位的模糊性得分（AScore），并参考补充文件1中的主要MSMS数据。物种栏：†碎片离子（包括中性损失）将氧化定位到残基313–315。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT-Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图8。 — **图3补充图8。全长AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1与重组PHD2反应后AKT1（421–436）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了AKT（421-436）肽的未氧化形式和P423ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P423ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。对应于未氧化AKT1（421–436）的峰由MSMS指定（颜色代码见插图）；未检测到P423ox。P423ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有可兼容氧化质量过量电荷的未分配离子。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图9。 — **图3补充图9。全长激活转录因子4与重组PHD3反应后ATF4（142-168）上肽氧化的定量。**
激活转录因子四个目标残基（P156、P162、P164、P167）的肽LC-MSMS分析需要用广泛特异性蛋白酶（弹性蛋白酶）消化；XIC数据对应丰富的片段离子，并且代表了包含一个或多个靶脯氨酸残基的重叠片段离子系列。注意，由于ATF4中靶脯氨酸残基的数量（在残基156-174之间定义了五个候选脯氨酸位点），因此未采用羟脯氨酸肽标准，这将需要大量肽标准来代表所有排列（包括多重氧化）。在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下，弹性蛋白酶消化IVTT底物的XIC数据。对应于未氧化ATF4（142–168）的峰值由MSMS指定；该肽（或相关肽）未检测到脯氨酸氧化。注意，根据LC-MS数据中观察到的同位素剖面（不同的单同位素质量和/或电荷），与m/z 962.8515和m/z 973.5148对应的未着色峰（RT:~69 min）是不相关的离子。在整个洗脱窗口中没有观察到用于羟基化的相容质量超过电荷的未分配离子；考虑了与ATF4（142–168）肽中靶脯氨酸数量相称的多达四次氧化（见插图）。观测物种的定量数据以饼图形式与XIC数据一起呈现。赋值和量化数据如下表所示，表标题如下：给定（RT）下领先赋值的显著性得分（−10lgP），PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）^+3个)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。

图3——补充图10。 — **图3补充图10。全长激活转录因子4与重组PHD3反应后ATF4（172-198）上肽氧化的定量。**
激活转录因子四个目标残基（P174）的肽LC-MSMS分析需要用广泛特异性蛋白酶（弹性蛋白酶）消化；图示的XIC数据对应丰富的碎片离子，并且代表了包含P174的重叠碎片离子系列。注意，由于ATF4中靶脯氨酸残基的数量（在残基156-174之间定义了五个候选脯氨酸位点），因此未采用羟脯氨酸肽标准，这将需要大量肽标准来代表所有排列（包括多重氧化）。在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下，弹性蛋白酶消化IVTT底物的XIC数据。对应于未氧化ATF4（172-198）的峰值由MSMS指定；该肽（或任何相关的含P174的肽）未检测到脯氨酸氧化。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。赋值和量化数据如下表所示，表标题如下：给定（RT）下领先赋值的显著性得分（−10lgP），PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺⁴)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。

图3——图补充11。 — **图3补充图11。全长着丝粒蛋白N与重组PHD2反应后CENPN（308-329）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了CENPN（308-329）肽的未氧化形式和P311ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义用于推导P311oxΔRT值的峰值最大值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化CENPN（308-329）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P311ox。P311ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。注意，根据LC-MS数据中观察到的同位素剖面（不同的单同位素质量和/或电荷），与m/z 792.4420对应的未着色峰（RT:54–56分钟）是不相关的离子。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观测物种的定量数据以饼图形式与XIC数据一起呈现。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观察质量的离子计数（面积）（MH⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽的检测效率的数据（图A，P:Hyp）是脯氨酸（P）与含羟丙基（Hyp）的物质的聚集比率。

图3——补充图12。 — **图3补充图12。全长中心体蛋白192（亚型1）与重组PHD1反应后CEP192（2306–2317）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了CEP192（2306–2317）肽的未氧化和P2313ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义用于推导P2313oxΔRT值的峰值最大值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD1反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化CEP192（2306–2317）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P2313ox。P2313ox的估计RT（ERT），源自(A类)，用垂直虚线表示；阴影对应于1分钟RT窗口。显示了与氧化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图13。 — **图3补充图13。全长真核延长因子2激酶与重组PHD2反应后EEF2K（94-111）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了EEF2K（94-111）肽的未氧化和P98ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括非酶蛋氨酸氧化（M95ox；绿松石），其洗脱接近含羟脯氨酸（P95ox，棕色）离子。垂直虚线定义用于推导M95ox和P98oxΔRT值的峰值最大值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。对应于EEF2K（94-111）的未氧化和M95ox形式的峰由MSMS指定；未检测到P98ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，由垂直虚线表示；ERT P98ox上的阴影对应于1分钟RT窗口，该窗口与M95ox的洗脱曲线部分重叠。注意，采用MS2离子平行反应监测的后续研究没有发现P98ox与M95ox在IVTT衍生材料中共同洗脱的证据（图3）。显示了与氧化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和定量数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：给定（RT）下领先分配的显著性得分（−10lgP），PTM定位的模糊性得分（AScore），并参考补充文件1中的主要MSMS数据。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图14。 — **图3补充图14。促红细胞生成素受体（274-508）细胞质域与重组PHD3反应后EPOR（426-453）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了EPOR（426-453）肽的未氧化和脯氨酸氧化形式（P443ox、P450ox或组合）的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于导出不同含羟脯氨酸肽的ΔRT值。注意，P443ox（棕色）和P450ox（绿松石色）离子的洗脱曲线重叠；通过将共洗脱峰与基线之间的谷垂直平分进行面积计算。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。在对照组和PHD3-反应IVTT制剂中检测到对应于未氧化（浅棕色）和低化学计量比单氧化（蓝色箭头）和双氧化（灰色箭头）形式的EPOR（426-453）的峰值。在单氧化肽（名义上定位于P438:AScore 0；MSMS见补充文件1 A-314）的上下文中，氧化位置不明确，并被指定为双氧化肽上的低置信色氨酸二氧化（W439:AScore 13.77；MSMS参见补充文件1 A-315和A-316）。低丰度氧化离子的洗脱曲线与含羟脯氨酸肽的预期保留时间（ERT）不同（用虚线表示；阴影对应于1分钟的RT窗口），并且与PHD3反应后的未氧化肽相比，洗脱曲线没有变化。在整个洗脱窗口中未观察到具有兼容氧化质量过量电荷的未分配离子（包括+16 Da和+32 Da物种）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。物种栏：片段离子（包括中性损失离子）将单氧化†定位为残基431-445，将二氧化定位为残留物431-442。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺⁴)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——图补充15。 — **图3补充图15。全长丝状蛋白A与重组PHD2反应后FLNA（2311–2333）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了FLNA（2311–2333）肽的未氧化和脯氨酸氧化形式（P2317ox、P2324ox或组合）的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是彩色的（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于导出不同含羟脯氨酸肽的ΔRT值。注意，相对于未氧化肽，双氧化肽（紫色）的比较离子计数高出4倍。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。在对照和酶反应条件下均检测到对应于未氧化FLNA（2311–2333）的峰值；在任何位点都没有脯氨酸氧化的报道。脯氨酸氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用垂直虚线表示；阴影对应于1分钟RT窗口。与单（+16 Da）或双（+32 Da）氧化事件相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子分别用粉红色和橙色箭头表示。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——图补充16。 — **图3补充图16。全长叉头盒O3与重组PHD1反应后FOXO3（420–444）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了FOXO3（420–444）肽的未氧化和脯氨酸氧化形式（P426ox、P437ox或组合）的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于导出不同含羟脯氨酸肽的ΔRT值。注意，P426ox（棕色）和P437ox（绿松石色）离子的洗脱曲线重叠；通过将共洗脱峰与基线之间的谷垂直平分进行面积计算。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD1反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。在对照和酶反应条件下均检测到对应于未氧化FOXO3（420–444）的峰值；脯氨酸氧化在任何部位均未见报道。脯氨酸氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用垂直虚线表示；阴影对应于1分钟RT窗口。显示了与单一（+16 Da）氧化事件兼容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）；在整个洗脱窗口中未观察到具有双重氧化（即+32 Da）兼容质量过量电荷的未分配离子。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽的检测效率的数据（图A，P:Hyp）是脯氨酸（P）与含羟丙基（Hyp）的物质的聚集比率。

图3——图补充17。 — **图3补充图17：核因子κB激酶β亚基全长抑制剂与重组PHD1反应后IKBKB（172-198）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示在(A类)显示了IKBKB（172-198）肽的未氧化和P191ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P191ox的ΔRT值。由于不清楚的原因，P191ox肽标准品可重复显示一个小峰，在主峰前约0.5分钟洗脱（计算ΔRT值）。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD1反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化IKB（172-198）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P191ox。P191ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中观察到具有相容质量的未分配离子超过羟基化电荷，但在与PHD1反应后，其相对丰度保持不变（粉红色和箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——图补充18。 — **图3-图补遗18……以下反应后NDRG3（287-301）上肽氧化的定量N个-末端截短的NDRG3（残基108–375）与重组PHD2。**
XIC数据显示于(A类)显示了胰蛋白酶NDRG3（287-301）肽的未氧化和P294ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种（包括非酶氧化）是有色的（见插图）；垂直虚线定义了峰值最大值，用于推导关键氧化离子的ΔRT值。 (B类)显示在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。对应于NDRG3（287–301）的未氧化和M287ox形式的峰由MSMS指定（颜色代码见插图）；未检测到P294ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，由垂直虚线表示，应用于ERT P294ox的阴影对应于1分钟RT窗口。还显示了与氧化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和定量数据如下所示：（−10lgP）在给定（RT）下领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore），并参考补充文件1中的主要MSMS数据。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT-Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽检测效率的数据（面板A，P:Hyp）是脯氨酰（P）和羟基脯氨酰基（Hyp）物种的聚合比率。

图3——补充图19。 — **图3补充图19。全长磷酸二酯酶4D（亚型6）与重组PHD2反应后PDE4D（370-383）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了PDE4D（370-383）肽的未氧化形式和P382ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括低丰度非酶蛋氨酸氧化（M371ox；绿松石）；垂直虚线定义用于导出M371ox和P382oxΔRT值的峰值最大值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。对应于PDE4D（370-383）的未氧化型和M371ox型的峰由MSMS指定；未检测到P382ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用垂直虚线表示，并显示IVTT衍生的M371ox在ERT附近洗脱；应用于ERT P382ox的阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图20。 — **图3补充图20。全长磷酸二酯酶4D（亚型6）与重组PHD2反应后PDE4D（411-431）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了PDE4D（411-431）肽的未氧化形式和P419ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括非酶蛋氨酸氧化（M424ox；绿松石），以裂峰形式洗脱；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P419ox和M424ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。对应于PDE4D（411-431）的未氧化和M424ox形式的峰由MSMS指定（颜色代码见插图）；未检测到P419ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，由垂直虚线表示，应用于ERT P419ox的阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中没有观察到用于羟基化的相容质量超过电荷的未分配离子。注意，m/z 611.0797的XIC中检测到无关离子；绿松石阴影对应于单同位素MSMS指定的M424ox物种。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观察质量的离子计数（面积）（MH⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图21。 — **图3补充图21。全长丙酮酸激酶M2与重组PHD3反应后PKM（401-422）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了PKM（401-422）肽的未氧化和脯氨酸氧化形式（P403ox、P408ox或组合）的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于导出不同含羟脯氨酸肽的ΔRT值。注意，P403ox（棕色）和P408ox（绿松石色）离子的洗脱曲线重叠；通过将共洗脱峰与基线之间的谷垂直平分进行面积计算。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。在对照和酶反应条件下均检测到对应于未氧化PKM（401-422）的峰；脯氨酸氧化在任何部位均未见报道。脯氨酸氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用垂直虚线表示；阴影对应于1分钟RT窗口。显示了与单一（+16 Da）氧化事件兼容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）；在整个洗脱窗口中未观察到具有双重氧化（即+32 Da）兼容质量过量电荷的未分配离子。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图22。 — **图3补充图22。全长蛋白磷酸酶2调节亚基Bα与重组PHD2反应后PPP2R2A（310-330）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于**（A）**)显示了PPP2R2A（310-330）肽的未氧化形式和P319ox形式的等摩尔合成肽标准品的离子强度和保留时间（RT）特性。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括非酶蛋氨酸氧化（M315ox；绿松石）；垂直虚线定义了用于推导M315ox和P319ox的ΔRT值的峰值最大值。注意，MSMS将室温50.5 min时m/z 685.0814对应的峰值指定为W311diox；XIC上没有说明这种非酶氧化。面板(B类)显示了在对照（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化的IVTT底物的可比XIC数据。对应于PPP2R2A（310-330）的未氧化型和M315ox型的峰由MSMS指定；未检测到P319ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用垂直虚线表示，并显示IVTT衍生的M315ox洗脱靠近ERT；应用于ERT P319ox的阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺⁴)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图23。 — **图3补充图23。全长芽孢同系物2与重组PHD3反应后SPRY2（5-19）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了SPRY2（5–19）肽的未氧化形式和P18ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P18ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化SPRY2（5–19）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P18ox。P18ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图24。 — **图3-图补充24.全长芽状同源物2与重组PHD1反应后SPRY2（135–151）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了SPRY2（135–151）肽的未氧化和P144ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是彩色的（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P144ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD1反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化SPRY2（135–151）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P144ox。P144ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。显示了与羟基化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图25。 — **图3补充图25。全长芽孢同系物2与重组PHD3反应后SPRY2（135–151）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了SPRY2（135–151）肽的未氧化和P144ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P144ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化SPRY2（135–151）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P144ox。P144ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——图补充26。 — **图3补充图26.全长芽状同源物2与重组PHD1反应后SPRY2（156–168）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了SPRY2（156-168）肽的未氧化形式和P160ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是彩色的（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P160ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD1反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化SPRY2（156–168）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P160ox。P160ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——图补遗27。 — **图3补充图27。全长芽孢同系物2与重组PHD3反应后SPRY2（156-168）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了SPRY2（156-168）肽的未氧化形式和P160ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P160ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化SPRY2（156–168）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P160ox。P160ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中未观察到具有相容质量的未分配离子超过羟化电荷。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。关于合成肽的检测效率的数据（图A，P:Hyp）是脯氨酸（P）与含羟丙基（Hyp）的物质的聚集比率。

图3——补充图28。 — **图3补充图28。全长端粒维持2与重组PHD3反应后TELO2（363–377）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示在(A类)显示了TELO2（363–377）肽的未氧化和P374ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P374ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化TELO2（363–377）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P374ox。P374ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中观察到羟基化的未分配离子，其相容质量超过电荷，但在与PHD3反应后，其相对丰度保持不变（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——图补充29。 — **图3补充图29。全长甲状腺激素受体α与重组PHD2反应后THRA（153-176）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了THRA（153-176）肽的未氧化和脯氨酸氧化形式（P160ox、P162ox或组合）的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于导出不同含羟脯氨酸肽的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。在对照组和PHD2-反应IVTT制剂中检测到对应于未氧化（浅棕色）和低化学计量比单氧化（蓝色箭头）和双氧化（灰色）形式THRA的峰值。在单氧化肽（标称定位于P162或D166:AScore 0；MSMS分别参见补充文件1 A-306和A-307）的上下文中，氧化位置不明确，并被指定为双氧化肽上的色氨酸二氧化（W439:AScore 1000；MSMS参见补充文件1A-308和A-309）。低丰度单氧化离子的洗脱曲线在色谱上与含羟脯氨酸肽的预期保留时间（ERT）不同（>5 min）（用虚线表示；阴影对应1 min RT窗口）与PHD2反应后，与未氧化肽相比，无明显变化。显示了与单一（+16 Da）氧化事件兼容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）；在整个洗脱窗口中未观察到具有双重氧化（即+32 Da）兼容质量过量电荷的未分配离子。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。物种栏：片段离子（包括中性损失离子）将单氧化†定位到残基165-166（见补充文件1，A-306）。定量数据报告观察质量的离子计数（面积）（MH⁺⁵)随时间积分（RT-Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图30。 — **图3补充图30。全长甲状腺激素受体α与重组PHD3反应后THRA（153-176）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了THRA（153-176）肽的未氧化和脯氨酸氧化形式（P160ox、P162ox或组合）的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于导出不同含羟脯氨酸肽的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。在对照和PHD3-反应IVTT制剂中检测到对应于未氧化（浅棕色）和低化学计量比单氧化（蓝色箭头）和双氧化（灰色）形式THRA的峰值。在单氧化肽（名义上定位于D166:AScore 0；见补充文件1 A-306）的上下文中，氧化位置不明确，并被指定为双氧化肽上的色氨酸二氧化（W165:AScore1000；见补充文档1 A-308和A-311，MSMS）。低丰度单氧化离子的洗脱曲线在色谱上与含羟脯氨酸肽的预期保留时间（ERT）不同（>5 min）（用虚线表示；阴影对应1 min RT窗口）与PHD3反应后，与未氧化肽相比，无明显变化。显示了与单一（+16 Da）氧化事件兼容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）；在整个洗脱窗口中未观察到具有双重氧化（即+32 Da）兼容质量过量电荷的未分配离子。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。物种栏：片段离子（包括中性损失离子）将单氧化†定位到残基165-166（见补充文件1，A-306）。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺⁵)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——图补遗31。 — **图3补充图31。全长肿瘤蛋白p53与重组PHD1反应后TP53（140-156）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了TP53（140-156）肽的未氧化和P142ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P142ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD1反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。MSMS指定了对应于未氧化TP53（140-156）的峰值（颜色代码见插图）；未检测到P142ox。P142ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由垂直虚线表示，阴影对应于1分钟的RT窗口。注意，根据LC-MS数据中观察到的同位素剖面（不同的单同位素质量和/或电荷），与m/z 963.9725对应的未着色峰（RT:50.5 min）是不相关的离子。在整个洗脱窗口中没有观察到用于羟基化的相容质量超过电荷的未分配离子。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观察质量的离子计数（面积）（MH⁺²)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——补充图32。 — **图3补充图32。全长肿瘤蛋白p53与重组PHD3反应后TP53（358-370）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了TP53（358-370）肽的未氧化和P359ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种有颜色（见插图）；垂直虚线定义峰值最大值，用于推导P359ox的ΔRT值。注意，与未氧化肽（浅棕色）相比，P359ox（棕色）的比较离子计数低2.5倍。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD3-反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。对应于未氧化TP53（358-370）的峰由MSMS指定（颜色代码见插图）；未检测到P359ox。P359ox的估计RT（ERT），源自(A类)，由虚线垂直线表示，阴影对应于1分钟RT窗口。还显示了与氧化相容但未被MSMS指定的低丰度肽离子（粉红色箭头）。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。

图3——图补遗33。 — **图3补充图33。全长瞬时受体电位阳离子通道亚家族A成员1与重组PHD2反应后TRPA1（391-403）上肽氧化的定量。**
XIC数据显示于(A类)显示了TRPA1（391-403）肽的未氧化和P394ox形式的等摩尔合成肽标准的离子强度和保留时间（RT）特征。MSMS指定的物种是有色的（见插图），包括低丰度非酶蛋氨酸氧化（M397ox：绿松石；M399ox：紫色）；垂直虚线定义了峰值最大值，用于推导P394ox、M397ox和M399ox的ΔRT值。面板(B类)显示了在控制（左）或PHD2反应（右）条件下蛋白酶消化IVTT底物的可比XIC数据。对应于未氧化和甲硫氨酸氧化形式的峰由MSMS分配；未检测到P394ox。氧化肽的估计RT（ERT）值，来源于(A类)，用垂直虚线表示，显示IVTT衍生的M397ox和M399ox在ERT附近洗脱；应用于ERT P394ox的阴影对应于1分钟RT窗口。在整个洗脱窗口中没有观察到用于羟基化的相容质量超过电荷的未分配离子。观察物种的定量数据以饼图和XIC数据表示。分配和量化数据在每个面板下方制成表格，表格标题如下：（−10lgP）给定（RT）领先分配的显著性得分，PTM定位的模糊性得分（AScore）以及补充文件1中主要MSMS数据的参考。定量数据报告观测质量（MH）的离子计数（面积）⁺³)随时间积分（RT Win.），表示为相对丰度（RA）。合成肽的检测效率数据（面板A，P:Hyp）是含脯氨酰（P）和羟基脯氨酸（Hyp。表A报告了双氧化和三氧化形式的TRPA1（391–403）的值，用于推导P:Hyp比率；为了清楚起见，XIC数据中仅说明了单一氧化离子。

图4。 — **图4通过质谱法对氧化EEF2K（94-111）和NDRG3（287-301）肽物种的平行反应监测（PRM）。**
根据现有MSMS数据（补充文件1:A167-169和A207-209），选择碎片离子（n=5），包括脯氨酸和蛋氨酸氧化的鉴别质量离子（碎片离子示意图见插图；虚线：未氧化，实线：氧化）进行PRM采集。图中显示了对应于氧化形式的PRM碎片离子的XIC数据(A类)EEF2K（94-111）和(B类)NDRG3（287–301）来源于（i）对照或(**ii（ii）**)PHD2-反应条件。在整个洗脱曲线中未观察到表明脯氨酸氧化的碎片离子质量。注意，y轴被截断，以显示较低丰度的碎片离子（面板A和B的最大峰值：>1×10⁶离子计数）。

图5。 — **图5.测量4-羟基相对量的放射化学分析[^三H] 报告底物与PHD酶孵育后形成的脯氨酸。**
基质由IVTT在*L（左）*-[2,3,4,5-^三H] 脯氨酸，并与指示的重组PHD酶孵育或不孵育。转化为4-羟基[^三H] 脯氨酸通过放射化学分析测定，数据表示为DPM-Hyp/1×10⁶DPM Pro，未减去PHD的反应的DPM。HIF-1α（WT）阳性对照证实了检测效力。背景DPM范围用阴性PP/AG HIF-1α（P402A，P564G脯氨酸突变）对照测定。在PHD反应的非HIF底物中观察到的羟基化水平不高于背景。数据来自两个独立的分析，但以下情况除外（n=1）：PKM（PHD3）；TELO2（PHD3）；TRPA1（PHD2）。

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什么时候目标不是目标？
Bersten DC，Peet DJ。 Bersten DC等人。埃利夫。2019年9月12日；8:e50585。doi:10.7554/eLife.50585。埃利夫。2019 PMID：31513015 免费PMC文章。

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[7] Chan MC、Ilott NE、Schödel J、Sims D、Tumber A、Lippl K、Mole DR、Pugh CW、Ratcliffe PJ、Ponting CP、Schofield CJ。通过抑制缺氧诱导因子（HIF）脯氨酸和天冬酰胺羟化酶调节缺氧转录反应。生物化学杂志。2016;291:20661–20673. doi:10.1074/jbc。M116.749291。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Chan MC、Ilott NE、Schödel J、Sims D、Tumber A、Lippl K、Mole DR、Pugh CW、Ratcliffe PJ、Ponting CP、Schofield CJ。通过抑制缺氧诱导因子（HIF）脯氨酸和天冬酰胺羟化酶调节缺氧转录反应。生物化学杂志。2016;291:20661–20673. doi:10.1074/jbc。M116.749291。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Chowdhury R、McDonough MA、MecinovićJ、Loenarz C、Flashman E、Hewitson KS、Domene C、Schofield CJ。低氧诱导因子与氧敏感脯氨酰羟化酶结合的结构基础。结构。2009;17:981–989. doi:10.1016/j.str.2009.06.002。-内政部-公共医学

[10] Chowdhury R、McDonough MA、MecinovićJ、Loenarz C、Flashman E、Hewitson KS、Domene C、Schofield CJ。低氧诱导因子与氧敏感脯氨酰羟化酶结合的结构基础。结构。2009;17:981–989. doi:10.1016/j.str.2009.06.002。-内政部-公共医学

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重组HIF脯氨酰羟化酶（PHD）在已报道的非HIF底物上缺乏活性

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