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.2019年10月：320:112981。
doi:10.1016/j.expneural.2019.112981。 Epub 2019年6月24日。

MicroRNA-34a通过靶向自噬相关基因9a介导乙醇诱导的神经嵴细胞神经分化损伤

华东范 1, 富强苑 2, 杨云 三, 吴婷（Ting Wu） 4, 蓝海路 5, 刘杰（音译） 6, 冯文科 7, 陈绍余 8
附属公司

MicroRNA-34a通过靶向自噬相关基因9a介导乙醇诱导的神经嵴细胞神经分化损伤

华东范等。 实验神经学. 2019年10月.

摘要

神经嵴细胞（NCC）是对乙醇敏感的多能干祖细胞，与胎儿酒精谱系障碍（FASD）有关。本研究的目的是测试乙醇暴露是否可以通过抑制自噬来抑制神经干细胞的神经分化，以及miR-34a是否参与乙醇诱导的神经干细胞自噬抑制。我们发现乙醇暴露会抑制神经干细胞的神经分化。乙醇暴露也显著降低了神经干细胞的自噬，如LC3II/I比率降低和p62蛋白表达升高所示。敲除p62可恢复乙醇暴露的神经干细胞中神经发生基因NF和Mash1的表达，表明乙醇暴露可通过抑制自噬抑制神经干细胞的神经分化。我们还发现，乙醇暴露导致NCC中miR-34a表达显著增加。抑制miR-34a可恢复Atg9a的表达，Atg9a是miR-34a的直接靶点，并显著降低乙醇诱导的NCC自噬抑制。下调miR-34a也可以阻止乙醇诱导的NCC神经分化抑制。这些结果表明，乙醇诱导的NCC神经分化抑制是通过靶向Atg9a的miR-34a介导的。

关键词：Atg9a；自噬；区别；乙醇；神经嵴细胞；miR-34a。

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利益冲突

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数字

图1。
图1.BMP-2诱导的神经干细胞分化被乙醇暴露抑制。
用BMP-2（50 ng/mL）预处理24小时的NCC用或不用100 mM乙醇处理4、8、24或48小时。分化6天后，用Western Blot检测神经丝（NF）的蛋白表达。数据表示为对照的折叠变化，并表示三个单独实验的平均值±SEM。*，对<0.05, **,对与对照组相比<0.01。
图2。
图2：乙醇暴露显著降低了神经干细胞中Atg9a mRNA和蛋白的表达。
用50或100 mM乙醇处理神经干细胞24小时。mRNA（A）和蛋白（B）的表达附件9a分别通过qRT-PCR或Western Blot测定。数据表示为对照的折叠变化，并表示三个单独实验的平均值±SEM。*，对<0.05，**，对与对照组相比<0.01
图3。
图3：乙醇暴露导致神经干细胞自噬抑制和p62表达升高。
（A） 用50或100 mM乙醇处理NCC，并在乙醇暴露后4、8和24小时用Western Blot测定LC3 I和LC3 II的表达。（B） 用抗LC3抗体（针对LC3点）免疫荧光染色检测自噬体的形成。棒材，10μm。（C） 用100 mM乙醇处理神经干细胞24小时，分别用p62抗体（左面板）和DAPI（中面板）免疫荧光染色测定p62的表达。棒材，10μm。（D） 用100 mM乙醇处理NCC 4、8和24小时，用Western Blot测定p62的表达。数据表示为对照的折叠变化，并表示三个独立实验的平均值±SEM。ns，无统计差异，*，对<0.05, **,对与对照组相比<0.01。
图4。
图4：p62的敲除减少了乙醇诱导的NCC神经分化抑制。
用或不使用100 mM乙醇处理转染对照siRNA或p62-siRNA的NCC 24小时。通过Western Blot（A）和免疫荧光染色（B）分析NF和p62的蛋白表达。棒材，10μm。分别用RT-PCR和Western Blot检测Mash1的mRNA（C）和蛋白（D）表达。数据表示为对照的折叠变化，并表示三个单独实验的平均值±SEM。*，对<0.05, **,对<0.01 vs.控制。
图5。
图5：乙醇暴露显著增加了神经干细胞中miR-34a的表达。
用50或100 mM乙醇处理神经干细胞24小时。通过qRT-PCR测定miR-34a的表达。数据表示为对照的折叠变化，并表示三个单独实验的平均值±SEM。*，对<0.05, **,对<0.01，与对照组相比。
图6。
图6。。附件9a是NCC中miR-34a的直接靶点。
（A） miR-34a在3'-UTR中的预测结合位点附件9amRNA。（B） 荧光素酶报告子分析验证了miR-34a与3'-UTR的结合附件9a在NCC中。数据以控制百分比表示，并表示三个单独实验的平均值±SEM。**，对<0.01，与对照组相比。
图7。
图7抑制miR-34a可恢复Atg9a的表达，并显著逆转NCC中乙醇诱导的自噬抑制。
用100 mM乙醇处理转染对照抑制剂或miR-34a抑制剂的NCC 24小时。用Western Blot检测Atg9a和LC3 II/I的蛋白表达。数据表示为对照的折叠变化，并表示三个单独实验的平均值±SEM。*，对<0.05, **,对与对照组相比<0.01。
图8。
图8 miR-34a的下调阻止了乙醇诱导的NCC神经分化抑制。
用100 mM乙醇处理转染对照抑制剂或miR-34a抑制剂的NCC 24小时。信使核糖核酸的表达法国试验标准（A） 和马什1（C） 通过qRT-PCR分析。通过Western Blot（B）和（D）测定NF和Mash1的蛋白表达。数据表示为对照的折叠变化，并表示三个单独实验的平均值±SEM。*，对<0.05, **,对与对照组相比<0.01。
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