Preventing abnormal NF-κB activation and autoimmunity by Otub1-mediated p100 stabilization

doi:10.1038/s41422-019-0174-3

.2019年6月；29（6）：474-485。

doi:10.1038/s41422-019-0174-3。 Epub 2019年5月13日。

Otub1介导的p100稳定对NF-κB异常活化和自身免疫的预防作用

附属公司

¹美国德克萨斯州休斯顿市范宁街7455号，邮箱902，德克萨斯大学安德森癌症中心免疫学系，邮编77030。
²郑州大学第一附属医院河南省生殖与遗传学重点实验室生殖医学中心，河南郑州，450052。
^三河北大学附属医院中心实验室，河北保定，071000，中国。
⁴MD Anderson癌症中心UT健康生物医学研究生院，德克萨斯州休斯顿，77030，美国。
⁵美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院生物化学和分子生物学系，Verna和Marrs McLean，邮编77030。
⁶美国德克萨斯州休斯顿市范宁街7455号，邮箱902，德克萨斯大学安德森癌症中心免疫学系，邮编77030。ssun@mdanderson.org。
⁷MD Anderson癌症中心UT健康生物医学研究生院，德克萨斯州休斯顿，77030，美国。ssun@mdanderson.org。

PMID： 31086255
预防性维修识别码： PMC6796864型
内政部： 10.1038/s41422-019-0174-3

Otub1介导的p100稳定对NF-κB异常活化和自身免疫的预防作用

李延川等。单元格Res. 2019年6月.

.2019年6月；29(6):474-485.

doi:10.1038/s41422-019-0174-3。 Epub 2019年5月13日。

作者

附属公司

¹美国德克萨斯州休斯顿市范宁街7455号，邮箱902，德克萨斯大学安德森癌症中心免疫学系，邮编77030。
²郑州大学第一附属医院河南省生殖与遗传学重点实验室生殖医学中心，河南郑州，450052。
^三河北大学附属医院中心实验室，河北保定，071000，中国。
⁴MD Anderson癌症中心UT健康生物医学研究生院，德克萨斯州休斯顿，77030，美国。
⁵美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院生物化学和分子生物学系，Verna和Marrs McLean，邮编77030。
⁶美国德克萨斯州休斯顿市范宁街7455号，邮箱902，德克萨斯大学安德森癌症中心免疫学系，邮编77030。ssun@mdanderson.org。
⁷MD Anderson癌症中心UT健康生物医学研究生院，德克萨斯州休斯顿，77030，美国。ssun@mdanderson.org。

PMID： 31086255
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摘要

NF-κB是一个调节包括免疫反应在内的多种生物过程的转录因子家族，分别通过基于IκBα降解和IκB-like蛋白p100处理的经典和非经典途径激活。尽管p100对非经典NF-κB刺激有反应，但它不会发生降解，而是随着经典NFκB激活而累积。我们在这里表明，p100的稳定性受到一种氘化酶Otub1的严格控制。Otub1缺乏不仅促进信号诱导的p100处理和非经典NF-κB活化，而且导致稳态p100降解，导致经典途径中异常的NF-κB活化。Otub1的B细胞条件缺失导致B细胞增生、抗体过度产生和狼疮样自身免疫。Otub1缺陷的B细胞表现出异常激活的表型，并过度产生细胞因子IL-6，有助于自身免疫诱导。因此，Otub1维持p100的稳定性是NF-κB调节的一种不寻常机制，可防止自身免疫。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
Otub1作为p100结合蛋白的鉴定。一p100/Otub1结合的协同免疫沉淀（coIP）分析（上）和直接免疫印迹分析（下），使用转染有标记Otub1的HEK293细胞的全细胞裂解物以及空载体或编码所示IκB蛋白的表达载体来监测蛋白表达。b条全细胞裂解物由*Otub1型*^–/–用空载体或Flag-Otub1重组MEF，并进行coIP以检测Otub1-与内源性p100（上部）或直接免疫印迹分析（下部）的结合。**c（c）**未经处理的野生型脾B细胞全细胞裂解液中内源性Otub1/p100相互作用的CoIP分析。IgG下拉物被用作p100 IP的阴性对照。d日,**e（电子）**描述Otub1和Otub2域的示意图(d日)使用转染有指定表达载体的HEK293细胞的全细胞裂解物对p100/Otub1相互作用进行coIP分析(**e（电子）**).（f）,克描绘p100及其突变体结构域的示意图(**（f）**)使用转染有指定表达载体的HEK293细胞的全细胞裂解物对Otub1与p100突变体的相互作用进行coIP分析(克，上部）。细胞裂解物也进行直接免疫印迹，以监测p100突变体（p100 mut）和Otub1（lower）的表达

图2
Otub1调节基础和信号诱导的p100处理和非经典NF-κB激活。一,b条使用来自野生型（WT）和*Otub1型-*BKO（BKO）小鼠(一)或*Otub1型*^+/+（+/+）和*Otub1型*^–/–（–/–）主要MEF(b条). 基于三个独立实验，通过密度计对p100和p52条带进行定量，并表示为细胞质p100与细胞核p52的比率(一)或野生型值设置为1的细胞质p100和核p52的倍数(b条).c（c）野生型B细胞或MEF全细胞裂解物中p100和p52的免疫印迹分析。根据三个独立的实验，通过密度测定法对p100和p52条带进行量化，并以p100与p52的比值表示（右侧面板）。d日,**e（电子）**使用BAFF刺激的脾B细胞的细胞质或核提取物对指示蛋白进行免疫印迹分析(d日)或抗LTβR刺激的初级MEF(**e（电子）**).（f）从经处理的MG132制备全细胞裂解物（2小时）*Otub1型*^+/+和*Otub1型*^–/–MEF和接受p100 IP后，使用检测总泛素链（左）或K48链泛素链的抗体检测泛素化p100。免疫印迹法检测裂解液中p100和肌动蛋白的水平。克使用MG132处理的全细胞裂解物（用于2h）在Flag-Otub1和p100存在（+）或不存在（-）的情况下，用指示的HA标记泛素突变体转染HEK293细胞（仅表达指示的赖氨酸，所有其他赖氨酸突变为精氨酸）。小时,我如图所示，使用经MG132处理（2小时）的HEK293细胞的全细胞裂解物进行p100泛素化（上面板）和直接免疫印迹（下面板）分析。D/C/H代表Otub1 D88A/C91S/H265A突变体

图3
Otub1维持p100的稳定性并防止异常的典型NF-κB活化。一使用所示TLR配体刺激的野生型脾B细胞的全细胞裂解物对所示蛋白质进行免疫印迹分析。b条Pam3CSK4刺激的野生型脾B细胞中Otub1 mRNA的qRT-PCR分析。**c（c）**使用对照IgG或抗p100抗体对Pam3CSK4刺激的（24小时）野生型脾B细胞的全细胞裂解物进行IP处理，然后通过免疫印迹检测共沉淀的Otub1和p100（上部）。Otub1和p100的表达水平也通过免疫印迹分析（低）。d日,**e（电子）**使用野生型（WT）细胞质或细胞核提取物和*Otub1-BKO公司*脾B细胞(d日)或*Otub1型*^+/+和*Otub1型*^–/–MEF公司(**e（电子）**)按指示刺激。**（f）**qRT-PCR分析*Nfkb2号*Pam刺激野生型脾B细胞的mRNA_三CSK公司₄对于指定的时间段。时间0时野生型PCR产物数量的给定值设置为1。克p100泛素化（上部）和免疫印迹（下部）分析使用从野生型（WT）和*Otub1型*-Pam刺激的BKO脾B细胞_三CSK公司₄8小时，然后与MG132孵育2小时。小时–j个使用从野生型或*Otub1型*-如图所示，BKO脾B细胞受到刺激

图4
*Otub1型*-BKO小鼠表现出B细胞增生和异常抗体生成。一,b条B220的流式细胞术分析⁺或CD19⁺B细胞和TCRβ⁺野生型（WT）脾脏（SP）、腹股沟淋巴结（iLN）和腹腔（PerC）中的T细胞*Otub1型*-BKO小鼠（6-8个月大）。数据以代表性曲线表示(一)和基于多只小鼠的平均±SD值汇总图(b条，每个圆圈代表一只鼠标）。**c（c）**,d日B1（CD19）的流式细胞术分析⁺CD23型^–)和B2（CD19⁺CD23型⁺)野生型（WT）和*Otub1型*-BKO小鼠（6-8个月大）。**e（电子）**,**（f）**未成熟（Imm，B220）的流式细胞术分析⁺CD93型⁺)和成熟（B220⁺CD93型⁻)B细胞和滤泡（FO，B220⁺CD21型^整数CD23型⁺)和边缘区（MZ、B220⁺CD21型^你好CD23型⁻)野生型和非野生型脾脏中的B细胞*Otub1型*-BKO小鼠（6-8个月大）。克来自野生型和*Otub1型*-BKO小鼠（6-8个月大）。小时,我基于多种野生型和*Otub1型*-BKO小鼠（6-8个月大；每个圆圈代表一只小鼠）。j个,k个IgA的流式细胞术分析⁺脾脏中的B细胞（SP）和野生型和*Otub1型*-BKO小鼠（6-8个月大）。数据是三个独立实验的代表。对值由双尾未配对确定吨-测试*对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001

图5
Otub1调节NIK依赖性和NIK非依赖性NF-κB活化和B细胞发育。一,b条B220的流式细胞术分析⁺B细胞和TCRβ⁺WT脾脏（SP）、腹股沟淋巴结（iLN）和腹腔（PerC）中的T细胞，*NIK公司*-BKO，或*NIK/Otub1号机组*双BKO（dBKO）小鼠（8-10周龄）。数据以代表性曲线表示(一)和基于多只小鼠的平均±SD值汇总图(b条，每个圆圈代表一只鼠标）。**c（c）**,d日B1（CD19）的流式细胞术分析⁺CD23型⁻)和B2（CD19⁺CD23型⁺)WT腹腔内的细胞，*NIK公司*-BKO，或*NIK/Otub1号机组*-dBKO小鼠（8-10周龄），作为代表性地块展示(**c（c）**)和摘要图表(d日).e（电子）,**（f）**未成熟（Imm，B220）的流式细胞术分析⁺CD93型⁺)和成熟（B220⁺CD93型⁻)B细胞以及卵泡（FO，B220⁺CD21型^整数CD23型⁺)和边缘区（MZ、B220⁺CD21型^你好CD23型⁻)WT脾脏中的B细胞，*NIK公司*-BKO，或NIK/Otub1 dBKO小鼠（8-10周龄），作为代表图(**e（电子）**)和摘要图表(**（f）**).克–我使用BAFF或抗IgM刺激的脾B细胞的细胞质或核提取物对指示蛋白进行免疫印迹分析(克,我)或抗LTβR刺激的MEF(小时)由指定的小鼠制备。数据是三个独立实验的代表。对值由双尾未配对确定吨-测试*对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001

图6
*Otub1型*-BKO小鼠产生卢布样自身免疫。一ELISA检测未免疫野生型或*Otub1-BKO公司*小鼠（10个月大）。b条免疫荧光显微镜观察未免疫野生型和*Otub1-BKO公司*老鼠。切片用DAPI（蓝色）和Alexa Fluor 488抗鼠IgG（绿色）染色。比例尺，100μm。通过ImageJ软件对信号强度进行量化。数据以代表图（左面板）和汇总图（右面板）的形式显示。**c（c）**野生型和*Otub1型*-未经治疗（NT）或注射（i.p.）BM12小鼠CD4 T细胞的BKO小鼠。d日,**e（电子）**Fas的流式细胞术分析⁺GL-7型⁺生发中心B细胞和B220⁻CD138型⁺野生型和*Otub1型*-在指定的时间段内，未接受BM12小鼠CD4 T细胞治疗（NT）或注射（i.p.）的BKO小鼠。数据以代表图（左）和基于多个受体小鼠的汇总图（右）的形式呈现。**（f）**ELISA检测野生型和非野生型血清中抗双链DNA（抗dsDNA）和核抗原（ANA）的自身抗体*Otub1型*-BKO小鼠用来自BM12小鼠的CD4 T细胞注射（i.p.）指定的时间段。克野生型和野生型肾切片中IgG沉积的免疫荧光显微镜检查*Otub1型-*BKO小鼠在指定的时间段内（i.p.）注射BM12小鼠的CD4 T细胞。切片用DAPI（蓝色）和FITC抗鼠IgG（绿色）染色。比例尺，100μm。通过ImageJ软件对荧光信号进行量化。数据以代表图（左面板）和汇总图（右面板）的形式显示。数据是三个独立实验的代表。对值由双尾未配对确定吨-测试*对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001

图7
Otub1缺乏导致异常的B细胞激活。一门控B220上指示激活标记的流式细胞术分析⁺来自未免疫野生型或*Otub1型*-BKO小鼠（8-10周龄），显示为代表性直方图（上部）和中值荧光强度（MFI）总结图（下部）。b条门控B220上CD23和CD86的流式细胞术分析⁺来自野生型或*Otub1型*-BKO小鼠在指定的时间段内（i.p.）注射BM12 CD4 T细胞。数据以代表性直方图（左）和中值荧光强度（MFI）汇总图（右）表示。**c（c）**10个月龄未经治疗野生型和*Otub1型*-BKO小鼠。d日ELISA检测8周龄野生型和*Otub1型*-BKO小鼠在指定的时间段内注射BM12 CD4 T细胞。**e（电子）**,**（f）**酶联免疫吸附试验(**e（电子）**)和qRT-PCR(**（f）**)野生型或非野生型IL-6表达分析*Otub1型*-未经诱导剂处理（–）或刺激（+）的BKO脾B细胞。克ELISA检测野生型和非野生型血清中抗核抗原（ANA）或双链DNA（抗dsDNA）的自身抗体*Otub1型*-使用BM12 CD4 T细胞对BKO小鼠进行指定时间段的治疗，并重复注射抗IL-6或大鼠IgG1同型对照物（每3天一次）。小时,我Fas频率的流式细胞术分析⁺GL-7型⁺生发中心B细胞(小时)和B220⁻CD138型⁺浆细胞(我)野生型和*Otub1型*-用BM12 CD4 T细胞治疗BKO小鼠3周，并重复注射抗IL-6或大鼠IgG1同型对照物（每3天一次）。数据是两个独立实验的代表。对值由双尾未配对确定吨-测试*对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001

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1. Senftleben U等。第二个进化保守的NF-kB信号通路的IKKa激活。科学。2001;293:1495–1499. doi:10.1126/science.1062677。-内政部-公共医学

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