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.2018年10月1日；217(10):3446-3463.
doi:10.1083/jcb.201705127。 Epub 2018年8月28日。

Cdt1通过极光B激酶依赖机制稳定动粒-微管连接

什万吉·阿加瓦尔 1, 凯尔·保罗·史密斯 1, 周一卓 2, 澳大利亚铃木 三, 理查德·麦肯尼 4, 迪利普·瓦尔马 5
附属公司

Cdt1通过极光B激酶依赖机制稳定动粒-微管连接

什万吉·阿加瓦尔等。 J细胞生物学. .

摘要

牢固的动粒微管（kMT）附着对准确的染色体分离至关重要。以Ndc80复合依赖方式定位于动粒的人类Cdt1的G2/M特异性缺失导致异常的kMT附着和有丝分裂阻滞。这表明Cdt1除了在DNA复制起源许可中的原型功能外，还具有独立的有丝分裂作用。这里，我们显示Cdt1直接与微管（MT）结合。内源性或瞬时表达的Cdt1定位于有丝分裂纺锤体MT和动粒。Cdt1的缺失映射表明，有效的MT结合需要包含中间和C末端翼螺旋结构域但缺少N末端非结构化区域的区域。有丝分裂激酶Aurora B与Cdt1相互作用并磷酸化Cdt1。Aurora B类磷酸化Cdt1表现出MT结合减弱，其细胞表达诱导kMT附着缺陷，伴随有丝分裂进程延迟。因此，我们提供了Cdt1如何以Aurora B激酶磷酸化依赖方式影响kMT整体稳定性的机制性见解；其目的是增加Ndc80络合物的MT-结合。

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数字

图1。
图1。
Cdt1是一种新型的MT-结合蛋白。（A）人类Cdt1疾病预测。无序预测（10个程序的总和）绘制为残差数的函数。（B）全长Cdt1的七个同源模型；颜色从N端（蓝色）到C端（红色），低置信或低重叠区域显示为半透明。为清晰起见，分别以灰色和黑色显示并对齐保留的WHM和WHC域。放大是PyMol渲染的卡通表示，显示了使用Phyre2服务器生成的C末端人类Cdt1（410–546 aa，红色）的叠加，具有小鼠C末端Cdt1（420–557 aa）的可用NMR结构（PDB ID:2KLO；绿色）。（C）本研究中使用的结构，全长Cdt1（1–546 aa），其缺失变体不含N末端92 aa（92–546），以及与N末端GFP标签融合产生的N末端和C末端缺失变体，用于细菌表达，显示为黑色条。无序域显示为蓝色，WHM域显示为黄色，WHC域显示为红色。（D）SDS-PAGE（15%）显示纯化重组蛋白以及从猪脑纯化的天然微管蛋白。M、 分子质量标准；*，Cdt1中的降解带（通过Western blot确认）92–410箭头指向与感兴趣的蛋白质对应的带。（E）显示Cdt1 MT共沉积的蛋白质印迹92–546（GFP标记）和全长Cdt11–546（无任何标签），每个1µM；从细菌中纯化出具有指定浓度的紫杉醇稳定的MT（单位：μM）。通过Western blot分析作为上清液（S）和颗粒（P）分馏的样品，并用6×-His标签或抗Cdt1抗体检测每个病例中的Cdt1。Ponceau S染色微管蛋白。（F）定量（平均值±标准差，n个=Cdt1的3）92–546和Cdt11–546使用ImageJ进行印迹。拟合得到的95%CI值为0.60–0.94B类最大值，0.37–4.04适用于K（K）d日前一个构造的背景为0.07–0.29；和0.63–0.79B类最大值，1.33–3.25适用于K（K）d日和0.08–0.18作为后一个构造的背景。（G）在具有指示MT浓度的共沉淀试验中，指示缺失片段与MT结合的代表性Western blot（顶部）。（H）结合定量（平均值±SD，n个=3）删除片段到MTs。（一）量化Cdt1最小C末端片段Cdt1的MT-结合410-546和三个独立实验的代表性Western blot（顶部）（平均值±SD，n个= 3).（J）斑点重叠法研究Cdt1–Hec1相互作用。将指示的蛋白质（每个0.5µg）作为诱饵装载在18%SDS-PAGE凝胶上，转移到硝化纤维素膜上，并用5%SM-TBST封闭。Hec1:：Nuf2-His二聚体复合物（1µg；加利福尼亚大学圣地亚哥分校La Jolla分校a.Desai和D.Cheerambathur慷慨赠送的礼物）作为猎物蛋白质在4°C下覆盖在膜上12 h。用抗Hec1抗体（1:2000；9G3；Abcam）清洗并探测印迹，然后进行化学发光。用Ponceau S进行了相同的杂交。
图2。
图2。
Cdt1在体外扩散到MT上，在体内修饰纺锤形MT。（A）Cdt1的典型Western印迹92–546（1µM）与1和4µM浓度的完整（MT）或枯草杆菌素处理（ST-MT）微管共沉淀。（B）A的量化（平均值±SD，n个=3）。双侧非配对非参数学生的显著性评估吨测试。（C）Cdt1共沉积的量化92–546（1µM），含16µM MT，不含（+MT）和存在（+MT+S；顶部）250 mM NaCl；平均值±SD，n个=3。P<0.005代表由双侧非配对非参数学生的吨测试。所示为典型的Western印迹（底部）。（D）单通道和合并TIR-FM图像显示表面固定化Dylight405标记的MT（蓝色）和GFP标记的Cdt192–546（绿色）。（E）Cdt1的Kymograph分析92–546与MT晶格的相互作用。（F）Cdt1的累积频率图和指数拟合92–546停留时间。n个=304分子，两种独立的蛋白质制剂。（G）Cdt1扩散系数分析92–546使用DiaTrack粒子跟踪软件执行的MT。插图显示了Cdt1粒子数的直方图分布92–546在0–1µm范围内扩散到MT上的2/第条。（H）未转染有丝分裂HeLa细胞，用抗Cdt1和抗Hec1抗体（顶部，第i和ii幅）或抗微管蛋白抗体（底部，第iii至vi幅）染色。比例尺，5µm。如图所示，是HeLa细胞有丝分裂不同阶段Cdt1动粒（抗-Cdt1/红色和抗-Hec1/绿色）和纺锤体（抗-Cdt1/红色以及抗-微管蛋白/绿色）染色的代表性图像。面板iv–vi中的橙色箭头表示纺锤极处的Cdt1染色；第五组中的黄色箭头表示晚期卵裂沟处的Cdt1染色，第六组中的绿色箭头表示晚期重组核处的Cdt1定位。（I和J）如图所示，用抗HA、抗Hec1和抗微管蛋白抗体对稳定转染（I）或瞬时转染（J）HeLa细胞进行免疫染色。比例尺，5µm。J中的中间和底部分别描绘了胞质分裂期和间期细胞的共聚焦图像，染色体的DAPI染色为蓝色。（K）J（左侧；另请参阅视频2）顶部面板中有丝分裂细胞图像堆栈的插图，以及视频3（右侧）中另一个细胞的示例。比例尺，1µm。（左）对模拟和转染的裂解物进行Western blot，以检测Cdt1（如图所示使用抗-HA或抗-Cdt1），并将小鼠微管蛋白作为负荷对照。表达，体外表达（带有C末端2×-HA、S-和12×-His-标记；缩写为HASH标记）；内源性，内源性（无标记）Cdt1。
图3。
图3。
Aurora B激酶在体外靶向Cdt1进行磷酸化，并影响Cdt1-MT结合。（A）使用Clustal Omega对指定物种的Cdt1进行序列比对。红色字体突出显示了潜在的Ser/Thr Aurora B站点。上面提到的是残基及其相对于全长人类Cdt1（1-546 aa）的位置。（B）在HEK 293–纯化的Cdt1或hVimentin（作为阳性对照）上，单独使用Aurora B或激酶加ZM447439抑制剂（10µM）进行体外激酶分析。图中显示了放射自显影（顶部）和考马斯染色凝胶（底部）。M、 分子质量标准在12%SDS-PAGE凝胶上的迁移（单位：千道尔顿）。（C）通过HA/His标记的Cdt1-WT或cy-Cdt1突变体从胸腺嘧啶同步化和诺卡唑阻滞有丝分裂HeLa细胞提取物中，阻断细胞周期蛋白A/Cdk结合（RRL[68-70]AAA），拉下Aurora B。使用镍进行下拉+2-NTA琼脂糖珠，然后用抗HA或抗Aurora B（AurB-K）抗体进行免疫印迹。1%的裂解液作为总蛋白装载。以表达GFP的HEK细胞作为对照。（D）HeLa细胞要么用Aurora B抑制剂ZM447439（5µM）处理1小时，要么不处理（对照），然后释放到每种情况下含有MG132（10μM）的培养基中。用抗Cdt1（红色）、抗微管蛋白（绿色）抗体对细胞进行免疫染色，并用DAPI复染以标记染色体（蓝色）；比例尺，5µm。（E） n个对=10个细胞进行量化，以获得D所示纺锤形MT上的标准化Cdt1荧光强度。P<0.0001表示双侧非参数Student’s评估的统计显著性吨测试。（F）示意图显示了全长Cdt1（546 aa）及其缺失变体，该缺失变体不含N-末端92 aa，与GFP标签融合生成，用于细菌中的表达。生成的以下两个蛋白质代表Aurora B磷酸拟态（8D，Ser/Thr被Asp取代）和磷酸缺乏（8A，Ser/Thre被Ala取代）Cdt1突变体。黑色星号，通过质谱法确认磷灰石；红色星号，从HEK 293细胞获得的Cdt1中固有磷酸化的残基。（G）显示了具有代表性的Western blot。将样品分为上清液（S）和颗粒（P），通过Western blot分析，用6×-His抗体探针检测Cdt1，用Ponceau S染色检测微管蛋白。（H）量化（平均值±标准偏差，n个=3）显示纯化Cdt1的MT共沉淀92–546或突变蛋白（每个蛋白1µM）与紫杉醇稳定的MT的指示浓度（μM）。每次拟合获得的95%置信区间为：B类最大值= 0.34–0.65,K（K）d日=0.43–10.57（对于8D）；B类最大值=0.36–0.67，K（K）d日=0–3.22（对于8A）。
图4。
图4。
Cdt1的极光B磷酸化调节kMT稳定性和有丝分裂进程。（A）用siRNA处理G2/M期内源性Cdt1的同步化HeLa细胞，并用稳定表达的siRNA-resistant Cdt1-WT、10D（磷酸化）、10A（非磷酸化）蛋白或载体控制（缩写为Vec，模拟Cdt1耗尽状态）拯救；用红色的Zwint1抗体（1:400稀释，动粒标记）、绿色的MT抗体（1:500稀释，纺锤标记）和黑白的DAPI抗体标记染色体。细胞在4°C下放置15分钟，然后固定和染色。比例尺，5µm。（B）柱状图显示了背景减影后每种情况下MT染色强度的量化(n个=10个单元格）。P<0.0001代表由双侧非配对非参数学生评估的统计显著性吨测试。（C）使用2×Laemmli缓冲液对经抗内源性Cdt1 siRNA处理的HeLa细胞进行裂解，并在10%SDS-PAGE凝胶上进行电泳。来自同步HeLa细胞裂解物的三个独立实验的代表性Western blot检测带有（底部）或不带有（顶部）Cdt1 siRNA（200 nM）的指示蛋白质的表达水平。表达，异位表达（带有HASH标签）；内源性，内源性（无标记）Cdt1；*在底部面板中，检测与Cdt1抗体反应的非特异性带。用GAPDH（1:8000）重复相同的印迹，作为样品回收对照。（D）量化所示每种条件下双附着、双定向动粒的百分比。动粒标记Zwint1为红色，MT为绿色。（E）在每种情况下，计算两个动粒对之间的动粒间（K-K）伸展并绘制(n个=115对；10个单元格）。P<0.001代表由双侧非配对非参数Student’s评估的统计显著性吨测试。还提供了代表性动粒对的裁剪图像，以指示其kMT附着和K-K拉伸的状态；比例尺，1µm。（F）在双胸腺嘧啶核苷同步化HeLa细胞中进行STLC洗脱试验，用抗内源性Cdt1的siRNA处理，用Cdt1-WT或Cdt1-10A解救，然后用STLC处理2 h。用MG132冲洗细胞并释放到含有MG132的培养基中，在洗脱开始后立即固定(吨=0）或1小时后(吨=60），然后固定和染色。DAPI是红色的假彩色标记染色体，微管蛋白是绿色的。（G）条形图显示STLC洗脱后指定时间点单极（早中期）与双极纺锤体（中期）结构的量化。对两个独立实验中两个盖玻片中的细胞进行计数；n个WT和10A分别为2114和2659吨= 60;n个WT和10A分别为565和785吨= 0. 数据绘制为y轴上具有单极或双极纺锤结构的有丝分裂细胞百分比。（H）在存在Cdt1 siRNA的情况下，在胸腺嘧啶核苷治疗释放后11.5和12.5小时，在稳定表达载体Cdt1-WT、Aurora B Cdt1-phosphosphamimetic（10D）或phospha-defective（10A）突变体的HeLa细胞中评估有丝分裂进展（中期到后期过渡）。从两个独立实验的三个不同盖玻片中计数和绘制有丝分裂每个阶段的细胞数量，以说明表达Cdt1-10D突变体的细胞与用Cdt1-WT或Cdt1-10A表达挽救的细胞相比有丝分裂延迟/停滞的性质(n个=600个单元；a和b表示使用双边非配对非参数Student’s吨在有丝分裂的指定阶段，对WT和10D进行测试）。（一）代表性图像如H所示；DAPI伪红色标记染色体，抗微管蛋白抗体将MT染成绿色。
图5。
图5。
质谱分析确定的四个位点的Cdt1极光B磷酸突变体部分影响kMT稳定性和有丝分裂进程。用抗内源性Cdt1的siRNA在G2/M期处理同步化HeLa细胞，并用稳定表达的siRNA-resistant Cdt1-WT、4D（磷酸化）、4A（非磷酸化）蛋白或载体控制（模拟Cdt1耗尽状态）挽救细胞，在固定和染色之前，接受4°C处理15分钟。（A）C细胞的代表性图像，用针对Zwint1（动粒标记）的抗体进行免疫染色，在合并图像的左侧，微管蛋白（MT）为绿色或黑白，DAPI为蓝色，标记染色体。比例尺，5µm。（B）柱状图显示了每个病例背景减影后冷处理后纺锤形MT染色强度的量化(n个= 7). P<0.05代表由双侧非配对非参数Student’s评估的统计显著性吨测试。（C）在存在Cdt1 siRNA（200 nM）的情况下，胸腺嘧啶核苷处理释放后11.5和12.5 h，在稳定表达Cdt1-WT、Cdt1-10D、Cdt1-10A、Cdt1~4D和Cdt1-4A突变体的HeLa细胞中测量有丝分裂进展（中期到后期过渡）。代表性图像显示自E；DAPI伪红色标记染色体，微管蛋白抗体标记MT绿色；比例尺，10µm。（D）从三个不同的盖玻片中计算并绘制出有丝分裂各阶段的细胞数，以说明Cdt1-4A/4D突变表达细胞与Cdt1-WT或Cdt1-10A/10D表达挽救细胞在有丝分裂延迟方面的差异(n个= 300); * 和#，P值显示了使用双侧非配对非参数Student’s获得的指示组之间的统计显著性吨测试。（E）示意图显示了三个指示的Aurora B位点发生突变，以在Cdt1中生成3D磷酸化突变体92–546父母背景。（F）用Cdt1进行的MT-沉淀实验的代表性Western印迹92–546以及Cdt1-3D突变体。将样品分为上清液（S）和颗粒（P），通过Western blot分析，用6×-His抗体探针检测Cdt1（WT或3D突变），并用Ponceau S染色检测微管蛋白。（G）量化（平均值±标准偏差，n个=3）显示纯化Cdt1的MT共沉淀92–546或突变蛋白（每个蛋白1µM）与紫杉醇稳定的MT的指示浓度（μM）。每次拟合获得的95%置信区间为：B类最大值= 0.8–1.0,K（K）d日=1.22–2.90（对于Cdt1）92–546;B类最大值=0.67–0.85，K（K）d日3D突变体=2.25–4.9。
图6。
图6。
对Aurora B磷酸化Cdt1突变体挽救的细胞进行的活细胞成像分析显示，有丝分裂进程严重延迟。（A）用质粒载体（类似于Cdt1缺失）或WT或Aurora B突变型Cdt1表达挽救的不同稳定细胞系活有丝分裂进展成像期间在指定时间点获得的时间进程和静止图像的方案。染色体用赫斯特染料标记。（另请参阅视频4、5、6和7。）（B）A.定量分析。如图所示，在y轴上绘制每个活体成像样品的中期板建立到每个成像有丝分裂细胞最终命运之间的时间（单位：分钟），包括延迟的后期发作或延长的有丝分裂停滞。双边非配对非参数Student’s评估的统计显著性吨测试。（C）脊椎动物相关动粒相关蛋白的MT-结合参数和磷酸化调节的比较表。（D）工作模型描述了Cdt1在Ndc80复合体Hec1亚基的CH和N末端尾结构域之外提供额外kMT连接位点的作用。Hec1和Nuf2中的CH域以及Hec1非结构化尾部绑定MT。Hec1的非结构化～40-aa环路区域通过与Cdt1的N末端1–320 aa相互作用来招募Cdt1（Varma等人，2012）。这以依赖于Cdt1与MT结合的方式诱导Ndc80复合体的构象改变。在中期，当动粒不是双向的时，Aurora B激酶通过磷酸化几个动粒蛋白（包括Ndc80（1）、Ska（2）和Cdt1（3））来稳定错误的附着本研究显示，所有这些蛋白都与MT结合。磷酸化后，这些蛋白对MT的亲和力降低。正如观察到的Ska复合物，在Aurora B磷酸化后不能与KMN网络有效交互（4）；Cdt1~P是否能以与未磷酸化的Cdt1相似的效率与Hec1环（5）对接仍不确定。中期，当极光B梯度在动粒处减小时，Cdt1能够与MT（6）结合，从而为kMT连接提供了除CH和Ndc80尾域之外的额外位置。Cdt1是否可以在自由或环结合状态下与Ska复合物相互作用，以及这种相互作用是否依赖于其磷酸化状态（7和8），尚待确定。该模型还描述了其他MAP与Hec1回路相互作用的可能性，无论是单独还是在Cdt1或Ska或两者的帮助下（9），如虚线箭头所示。
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参考文献

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