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.2018年6月28日；174（1）：218-230.e13。
doi:10.1016/j.cell.2018.04.039。 Epub 2018年5月24日。

基于RNA构象和TCAB1形成的人类端粒酶活性开关

陆晨 1, 凯特琳·M·罗克 1, 亚当·弗伦德 1, 佩德罗·巴蒂斯塔 2, 斯奇田 三, 易阿贤 1, 昌德雷什·加杰拉 1, 林圣达 1, 拜伦·李 2, 马修·F·佩奇 1, 安德鲁·斯文泰彻（Andrew S Venteicher） 1, Rhiju Das公司 三, 霍华德·Y·张 2, 史蒂文·阿尔坦迪 4
附属公司

基于TCAB1形成的RNA构象的人类端粒酶活性转换

陆晨等。 单元格. .

摘要

核糖核蛋白酶需要其RNA成分的动态构象来调节催化作用。人类端粒酶使用一种非编码RNA（hTR），该RNA具有两部分结构域——一个包含模板的核心和一个通过未知方式刺激催化作用的远端三向连接（CR4/5）。这里，我们表明端粒酶活性意外地依赖于全酶蛋白TCAB1，而全酶蛋白又控制CR4/5的构象。缺乏TCAB1的细胞在不影响酶组装的情况下，端粒酶催化作用显著降低。相反，TCAB1失活导致CR4/5螺旋的展开，这是催化和与端粒酶反转录酶（TERT）相关联所必需的。端粒生物学障碍患者的CR4/5突变引发催化和TERT结合缺陷，类似于TCAB1失活。这些发现揭示了人类端粒酶RNA中控制催化和TERT结合的构象“活性开关”。端粒酶两种离散催化状态的鉴定表明，分子内方法可以控制癌症和祖细胞中的端粒酶。

关键词：CAB箱；CR4/5；卡哈尔体；H/ACA RNP；RNA折叠；TCAB1；先天性角化不良；icSHAPE；端粒酶；端粒。

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数字

图1。
图1.TCAB1缺失影响人类细胞和小鼠细胞中的端粒酶活性
（A） CRISPR/Cas9介导的基因组编辑产生的TCAB1-KO-HeLa细胞克隆中TRAP的端粒酶活性。A8拯救，TCAB1-KO克隆A8稳定表达3HA-TCAB1。WT，父母的赫拉文化。Coilin-KO，带Coilin的HeLa克隆被破坏。IC，PCR效率的内部控制。显示了代表五个重复的凝胶。（B） 1A中端粒酶活性的定量，数值归一化为三个实验得出的WT.平均值±SEM，第页<1x10−7通过双尾Student’s T检验，对所有六个TCAB1-KO克隆的平均活性与WT对照和A8救援进行比较。（C） 用TRAP在1A中测定HeLa全细胞提取物的Western blotting。（D） TCAB1中TRAP的端粒酶活性flox/空（胚胎#3、#4）或TCAB1+/+（胚胎#5）用表达GFP或GFP-Cre融合的腺病毒处理的MEF。显示了代表三个重复的凝胶。（E） 1D中端粒酶活性的定量。三个实验得出的平均值±SEM。P（P）通过双尾学生T检验得出每行GFP与Cre的值。（F） 在1D中测定MEF全细胞提取物的Western blotting。主要抗体：抗GFP（顶部面板）、抗小鼠TCAB1（中部）、抗微管蛋白（底部）。（G） 通过CRISPR/Cas9-介导的基因组编辑产生的TCAB1-KO hESC克隆中TRAP的端粒酶活性（上图）。基于三个重复序列的端粒酶活性定量（中间）。P（P）通过双尾Student T检验，KO和WT克隆的值为0.0007。TCAB1蛋白的Western blot（低）。
图2。
图2.TCAB1缺失损害端粒的募集和端粒的维持，与完全组装的Cajal小体无关
（A-C）通过在亲代HeLa细胞、TCAB1-KO-HeLa细胞和coilin-KO-HeLa细胞中过度表达Flag-TERT和hTR来检测端粒酶对端粒的补充。（A） 联合IF检测TRF2和RNA FISH检测hTR；（B） 联合IF检测线圈蛋白和DNA FISH检测端粒重复序列；（C） TCAB1的联合IF和端粒重复的DNA FISH。比例尺，5μm源数据。（D） 与TRF2标记的端粒共定位的hTR病灶的平均数量的定量。对于每个基因型，端粒hTR病灶的数量计分>70个细胞核。误差线，S.E.M.学生T检验，p<0.0001。（E） 通过TRF-Southern blot测量亲本HeLa细胞和TCAB1-KO和Coilin-KO克隆细胞传代后的端粒长度。PD，人口翻倍。
图3。
图3.在缺乏TCAB1的细胞中，TERT-hTR催化核心的催化作用受损，但组装得以保留
（A） 使用多克隆抗TERT抗体对从指定核提取物中免疫纯化的内源性端粒酶RNP进行直接端粒酶引物延伸分析。WT，亲本HeLa细胞；TCAB1-KO，克隆D9、C1、A8；A8拯救，TCAB1-KO克隆A8稳定表达3HA-TCAB1；科林-KO。WT IgG IP，含亲本HeLa提取物的IP非特异性IgG。MW标准，100nt DNA梯。a5（21nt）+GGG，端粒DNA引物a5加上三个标记的鸟嘌呤；添加的残留物数量表示的其他延伸产品。RC，恢复控制。凝胶图像代表三个独立的实验。（B） 总催化速率，相对掺入速率32每RNP的P-GMP，通过结合所示凝胶通道（A）内所有延伸带的强度进行测量。数值归一化为WT RNP。平均值±SEM来自3个实验；第页<5×10−5TCAB1-KO与亲代HeLa的比较，p<5×10−4通过双尾Student T检验，TCAB1-KO与A8救援。（C） 重复图3A中测量的添加过程。测量每个端粒带的强度，用32合并P-GMP，并绘制与相应重复编号的对比图。重复添加过程(R（右）1/2)测量50%的酶分解前合成的重复次数，如下所示：R（右）1/2=−1n个22.303k个哪里k个=坡度。（D） 通过TERT的IP和hTR的northern印迹分析端粒酶催化核心的组装。检测来自（A）的内源性端粒酶RNP。输入，通过western blot分析指示蛋白；用northern blot检测hTR和U6 RNA。用TERT抗体免疫纯化的IP、端粒酶RNP通过TERT蛋白的western blot和hTR的northern blot检测。RRL TERT，兔网状裂解物（RRL）表达3xFLAG标记的TERT蛋白。IgG-IP，用于IP的非特异性IgG。
图4。
图4.TCAB1通过与CAB盒的相互作用刺激端粒酶活性
（A） 端粒酶RNP缺失TCAB1的各种3HA-TCAB1组分的生化重建示意图。（B） 通过抗HA亲和层析对来自稳定过度表达3HA-TCAB1的A8-HeLa克隆的纯化重组3HA-TCAB1组分进行银染。提取物要么用RNA酶处理，要么不处理，然后用抗HA珠纯化亲和力。珠结合的3HA-TCAB1要么通过3xHA肽竞争性洗脱，要么直接在SDS样品缓冲液中煮沸。星号、BSA信号来自相邻车道。（C） 溴化乙锭染色体外转录（IVT）RNA：WT-hTR、CAB框mu1（G414C）和CAB框mu2（G412C）。1x、3x、9×表示加载的相对卷。（D） 将重组3HA-TCAB1添加回缺乏TCAB1、TCAB1-KO RNP的亲和纯化端粒酶时，TRAP的端粒酶活性。使用来自A8 TCAB1-KO HeLa克隆的抗TERT抗体亲和纯化了端粒酶复合物。左图：添加所示3HA-TCAB1组分对纯化TCAB1-KO端粒酶RNP端粒酶活性的影响。右图：添加端粒酶RNA和端粒酶底物之前，用体外转录的hTRs（来自C）预孵育重组3HA-TCAB1的影响。三个独立重复的凝胶代表。
图5。
图5.TCAB1驱动hTR结构域中对催化至关重要的区域RNA折叠
（A） 端粒酶RNA hTR的结构域组成。矩形框中的单个域。用红色标记的TCAB1影响hTR基序。（B）亲和纯化的内源性端粒酶RNP通过icSHAPE进行化学修饰和残基柔性绘图。相对icSHAPE反应性比较亲本HeLa细胞（WT）、TCAB1-KO（A8）和A8拯救中亲和纯化的端粒酶RNA与TCAB1稳定过表达（TCAB1-KO遗传拯救）。显示了受TCAB1影响的反应性区域。误差条表示从两个技术副本中获得的icSHAPE值的标准偏差。X轴，主要hTR序列。（C） icSHAPE反应性差异分数通过比较两个端粒酶RNP得出，并映射到每个核苷酸位置的hTR二级结构。反应性差异增加以红色绘制；蓝色反应性差异减小。比较的具体RNP显示在每个结构的下面。DC mut1和mut2分别是从P6b和P6.1的先天性角化不良患者中分离出的hTR突变。重组3HA-TCAB1与缺失TCAB1的纯化端粒酶亲和后，hTR的CAB盒区（D）和CR4/5结构域（E）的（D-E）icSHAPE反应性差异得分。在添加icSHAPE修饰物之前，用TCAB1-KO RNP培养预处理、洗脱的RNase 3HA-TCAB1（图4B）体外试验。
图6。
图6 TCAB1敲除细胞和患者源性hTR突变体中受损的hTR CR4/5-TERT关联
（A） 通过过度表达3x FLAG表位标记的TERT和指示的hTR衍生物，对293T细胞中重组的纯化端粒酶RNP进行直接端粒酶引物延伸分析。在Flag抗体树脂上免疫纯化的端粒酶复合物。显示了代表三个实验的凝胶。（B） 总催化速率，相对掺入速率32每RNP的P-GMP，通过结合指定凝胶通道内所有延伸带的强度进行测量。数值归一化为WT RNP。平均值±SEM来自3个实验；第页通过双尾Student T检验，所有hTR衍生物与WT的差值均小于0.008。（C） 重复（A）的加成工艺性计算，如图3C所示。（D） TCAB1-KO细胞中3Flag-TERT和hTR片段加或减TCAB1表达之间的关联。用表达3FLAG-TERT的质粒瞬时转染TCAB1-KO细胞（A8），并指示hTR^PK片段（209–451）加上或减去3HA-TCAB1质粒。Flag抗体免疫富集组分的Northern印迹显示，低迁移率带代表内源性全长hTR和高迁移率hTR-ΔPK片段。印迹代表三个独立的实验。（E） 定量hTR-ΔPK片段与内源性全长hTR（D）之间的比率。通过双尾Student T检验从三个实验中得出平均值±SEM。
图7。
图7 TCAB1形成的端粒酶RNA构象活性开关
人类端粒酶RNA中基于RNA构象的活性开关控制端粒酶催化活性。人类端粒酶RNA由三个域组成：活性位点中的假结模板域、激活酶的CR4/5域和含有H/ACA元件和CAB盒的scaRNA域。TCAB1通过其WD40重复结构域与hTR的CAB盒结合，并在Cajal体内富集端粒酶。TCAB1与CAB盒相连时，有助于在CR4/5结构域内正确折叠RNA螺旋P6.1和P6b，并与TERT TRBD结构域最佳结合。通过适当折叠的活性开关，端粒酶处于高催化状态，端粒得以维持。在缺乏TCAB1（1）的情况下，活性开关折叠不当，导致低催化状态、贩运受损和招募减少，导致端粒缩短。先天性角化不良患者的P6.1（2）基因工程突变或P6.1或P6b基因突变（3）破坏了活性转换，模拟了TCAB1缺失的影响。
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