跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2018年3月8日；555(7695):265-268.
doi:10.1038/nature25787。 Epub 2018年2月28日。

真核细胞CMG解旋酶激活机制

马克斯·道格拉斯 1, 费尔多斯·阿比德·阿里 2, 亚历山德罗·科斯塔 2, 约翰·F·X·迪夫利 1
附属公司

真核细胞CMG解旋酶激活机制

马克斯·道格拉斯等。 自然. .

摘要

真核生物DNA复制的启动分为两个不连续的阶段：第一，微小染色体维持（MCM）复合体在G1期以头对头双六聚体的形式组装，围绕双复制源DNA；然后，“激发因子”在S期将每个双六聚体转化为两个活性的Cdc45-MCM-GINS螺旋酶（CMG）。第二阶段需要分离两条原始DNA链并重塑双六聚体，以便每个MCM六聚体围绕一条DNA链。在这里，我们表明在双六聚体形成过程中水解ATP的MCM复合物仍然与双六聚物中的ADP稳定结合。点火因素触发ADP释放，随后的ATP结合促进CMG组装的稳定。CMG组装伴随着初始DNA解扭曲和双六聚体分离为两种离散但无活性的CMG解旋酶。Mcm10与ATP水解一起触发进一步的DNA解捻和解旋酶激活。激活后，两个CMG解旋酶以“N末端-第一”方向移位，并在原点内相互传递；这要求每个解旋酶都完全与单链DNA结合。我们的实验阐明了真核生物复制解旋酶激活的机制，我们提出了一种双向复制体建立的故障安全机制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

扩展数据图1
扩展数据图1
CMG组装和激活是可分离的步骤。a、 为了确定CMG组装何时在我们的反应中饱和，在珠固定的ARS1 DNA上进行CMG组装，并在指定的时间用高盐洗涤缓冲液（HSW，缓冲液a+KCl）洗涤。数据显示，5分钟后没有发生新的CMG组装。b、 为了证实这一点，将MCM平行加载到珠固定的ARS1 DNA片段和可溶性ARS1质粒上，并用DDK磷酸化。只将除Mcm10外的完全燃烧因子混合物添加到可溶性反应中，然后在向可溶性反应中添加燃烧因子后指定的时间将其添加到珠固定化MCM中。8分钟后，用高盐（缓冲液A+KCl）清洗珠子，并通过免疫印迹分析结合蛋白。指示相对于车道2的Psf1信号。实验证实，在添加点火因子后5分钟内不会发生CMG装配。c、 为了测试即使在CMG组装完成后，Mcm10是否也能触发DNA解旋，反应如图1d所示，但在添加激发因子后所示的时间之前，Mcm1 0被省略。Mcm10触发了强劲的平仓，即使在开仓因素增加超过5分钟后。因此，Mcm10可以激活预装配的CMG以进行DNA解旋。d、 为了测试Mcm10能否激活预先组装的CMG进行复制，CMG被组装在固定的ARS1质粒±Mcm10上。用低（缓冲液A+0.25 M谷氨酸钾）或高（缓冲液A+KCl）盐缓冲液洗涤珠子，并添加复制蛋白±Mcm10和辅助因子，包括放射性标记的dCTP。即使在清洗CMG以去除多余的燃烧因子时，Mcm10也能实现DNA复制。e、 概述此处描述的CMG组装和CMG激活步骤的示意图。
扩展数据图2
扩展数据图2
a、 DNA解旋±RPA模型。b、 为了确定含有ARS1的放射性标记616 bp DNA环的不同拓扑异构体的相对位置（用于分析解旋分析中DNA超螺旋的微小变化），在指示的溴化乙锭浓度下，将刻痕环（nc，1道）连接闭合。通过跟踪谱带随溴化乙锭浓度增加而达到峰值的顺序以及DNA越来越呈负超螺旋的顺序，确定了共价闭合DNA不同谱带的超螺旋状态相对于基态（α）的变化（更多详细信息，请参见方法）。α-5的两个谱带在同一位置出现峰值，可能代表α-5拓扑异构象的替代构型。c、 在没有RPA的情况下，CMG组装后，用高锰酸钾处理616 bp的ARS1 DNA，进行引物延伸反应，读取ARS1的ARS-一致序列（ACS）的富T链。反应在5%的测序凝胶上分离，干燥并通过放射自显影术进行分析。基极对编号与ACS富T绞线的5'端有关。d、 如图2c所示。车道1表明，拓扑异构体分布中的所有班次都需要MCM加载。与其他对照样品（如–DDK）相比，在没有MCM的情况下，拓扑异构体分布略有不同；这并不是由于负载造成的，如图2b所示，负载不会影响拓扑异构体的分布。e、 如图2a所示，除了在所有反应中省略了Mcm10。在MCM负载后，除了拓扑异构酶之外，没有任何蛋白质被添加到泳道1中的反应中。当忽略每个单独的激发因子时，相对于未添加激发因子时（通道1），未观察到超螺旋的可检测变化，这表明在CMG组装期间发生了不含Mcm10的DNA解捻。
扩展数据图3
扩展数据图3
a、 使用[α32P] ATP按指示用DDK处理，并通过闪烁计数进行分析。误差条表示平均值的标准误差。b、 CMG组装反应的免疫印迹如图3d所示，并用低盐洗涤缓冲液（缓冲液A+0.25 M谷氨酸钾）洗涤。c、 使用[α]进行ATP酶分析32P] 在薄层色谱后，对所示的ATP、单MCM六聚体和Mcm10进行定量。误差条表示平均值的标准误差。
扩展数据图4
扩展数据图4
a、 所示解旋酶活化反应的示例显微照片和整套无参考级平均值，用高盐洗涤缓冲液（缓冲液a+KCl）洗涤23092个总颗粒中DDK、+Mcm10、7410为DH+在43320个总颗粒中，DDK，+Mcm10分别是CMG和DH，14668和10492+在12920个总颗粒中，DDK–Mcm10分别为CMG和DH，3984和2226。类是根据源粒子的丰度来定位的，最丰度的类位于左上角，丰度从左到右、从上到下依次递减。b、 如a所示，具有代表性的源显微照片。省略Dpb11或Sld3/7时，5032/6815和2049/20904颗粒为DH。比例尺表示100 nm。c、 在所指示的条件下形成的CMG的比较。HSW是缓冲液A+KCl，LSW是缓冲溶液A+0.25 M K-谷氨酸。d、 如图4d所示。e、 如图4e所示。箭头标记CMG的位置。f、 显微照片中的代表作物对所示样本进行成像。MCM列车标有箭头。当省略Mcm10或蛋白质路障时，未观察到列车。比例尺为100 nm。
图1
图1。用DNA解旋分析法分析复制解旋酶激活。
a、 b，分析大纲。c、 放松的时间过程。纯化的DNA产物在天然琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭染色。在“-蛋白质”反应中没有添加负载或激发因子。d、 如c中所示，省略了蛋白质。反应在40分钟后停止。
图2
图2。原点展开分两步进行。
a、 活性CMG组装在无RPA的放射性标记的616 bp ARS1环上40分钟，产物在天然双丙烯酰胺凝胶上分离。b、 与a中一样，除了忽略了所有点火因素。ATPγS中未发生MCM加载。c、 如a所示，省略了蛋白质。
图3
图3。CMG组装和激活与ATP结合和水解耦合。
a、 含有[α]的MCM加载反应32P] 用高盐（缓冲液A+NaCl）洗涤ATP，并用薄层色谱法进行分析。b、 如a所示，除洗涤反应与核苷酸孵育外，分析前再次洗涤。c、 用[α]在珠固定DNA上组装DHs32P] ATP用于CMG组装反应，通过闪烁计数分析上清液。误差条显示平均值的标准误差。d、 CMG组装反应的免疫印迹如扩展数据图1a所示，除了省略了CDK外，添加了Sic1，使用了用CDK预磷酸化的Sld2和Sld3/7，并添加了指示的核苷酸。在添加烧制因子后15分钟使反应骤冷。e、 如d所示，但对可溶性ARS1循环进行反应，并按图2a进行分析。在DDK磷酸化后使用自旋柱去除ATP。
图4
图4。复制解旋酶激活的结构特征。
a-c，用高盐（缓冲液a+KCl）洗涤的解旋酶活化反应的代表性无参考级平均值。显示了DH和CMG等级。所有粒子类均显示在扩展数据图4a中。d、 用高盐洗涤缺少Mcm10的解旋酶激活反应，并对其进行阳性染色以显示DNA。显示了两个CMG大小的粒子与单个DNA片段共定位的示例。显示了粒子之间的近似碱基对距离。比例尺表示50 nm。e、 与DH“火车”相邻的CMG在路障DNA上发生高盐洗反应的例子。比例尺为50 nm。f、 469列火车终点的注释无参考等级平均值。包括CMG结构（来自PDB文件3jc5）以供参考。火车头颗粒的2D分类为几个类别（i-iii），揭示了CMG子集（i和ii）上的圆环状聚合酶ε密度。g、 真核生物复制解旋酶组装和激活模型。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

  • Mcm10如何将复制前复合体转换为两个发散的DNA叉。
    [未列出作者] [未列出作者] 自然结构分子生物学。2024年5月31日。doi:10.1038/s41594-024-01333-3。打印前在线。 自然结构分子生物学。2024 PMID：38822110 没有可用的摘要。
  • 冷冻电镜显示真核生物复制起源的解开。
    Henrikus SS、Gross MH、Willhoft O、Pühringer T、Lewis JS、McClure AW、Greiwe JF、Palm G、Nans A、Diffley JFX、Costa A。 Henrikus SS等人。 自然结构分子生物学。2024年5月17日。doi:10.1038/s41594-024-01280-z。打印前在线。 自然结构分子生物学。2024 PMID：38760633
  • MCM8-9与HROB复合物中DNA解旋的机制。
    Acharya A、Bret H、Huang JW、Mütze M、Göse M、Kissling VM、Seidel R、Ciccia A、Guérois R、Cejka P。 Acharya A等人。 国家公社。2024年4月27日；15(1):3584. doi:10.1038/s41467-024-47936-8。 国家公社。2024 PMID：38678026 免费PMC文章。
  • MCM2-7复合物：超越DNA解开的作用。
    Rankin BD和Rankin S。 Rankin BD等人。 生物学（巴塞尔）。2024年4月13日；13（4）：258。doi:10.3390/biology13040258。 生物学（巴塞尔）。2024 PMID：38666870 免费PMC文章。 审查。
  • 十年的发现——复制终止时真核复制体的解体。
    Jones RM、Reynolds-Winczura A、Gambus A。 Jones RM等人。 生物学（巴塞尔）。2024年3月31日；13(4):233. doi:10.3390/biology13040233。 生物学（巴塞尔）。2024 PMID：38666845 免费PMC文章。 审查。
查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. Bell SP，Labib K。酿酒酵母中的染色体复制。遗传学。2016;203:1027–1067.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Coster G、Frigola J、Beuron F、Morris EP、Diffley JFX。原产地许可需要MCM复制螺旋酶的ATP结合和水解。分子细胞。2014;55:666–677.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kang S，Warner MD，Bell SP。Mcm2-7 ATP酶基序在复制启动期间的多重功能。分子细胞。2014;55:655–665.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ilves I，Petojevic T，Pesavento JJ，Botchan MR。通过与Cdc45和GINS蛋白结合激活MCM2-7解旋酶。分子细胞。2010;37:247–258.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Georgescu RE等。真核生物复制叉处不对称聚合酶组装的机制。自然结构分子生物学。2014;21:664–670.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语