Removal of RTF2 from Stalled Replisomes Promotes Maintenance of Genome Integrity

doi:10.1016/j.molcel.2017.11.035

.2018年1月4日；69（1）：24-35.e5。

doi:10.1016/j.molcel.2017.11.035。 Epub 2017年12月28日。

从停滞复制体中去除RTF2促进基因组完整性的维持

莫莉·C·科特曼¹, 布鲁克·A·孔蒂¹, 弗朗西斯·普拉赫¹, 阿加塔·斯莫戈泽夫斯卡²

附属公司

¹美国纽约州洛克菲勒大学基因组维护实验室，邮编10065。
²美国纽约州洛克菲勒大学基因组维护实验室，邮编：10065。电子地址：asmogorzewska@rockefeller.edu。

PMID： 29290612
预防性维修识别码： PMC6467090型
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.molcel.2017.11.035

从停滞复制体中去除RTF2促进基因组完整性的维持

莫莉·C·科特曼等。分子电池. 2018.

.2018年1月4日；69（1）:24-35.e5。

doi:10.1016/j.molcel.2017.11.035。 Epub 2017年12月28日。

作者

莫莉·C·科特曼¹, 布鲁克·A·孔蒂¹, 弗朗西斯·普拉赫¹, 阿加塔·斯莫戈泽夫斯卡²

附属公司

¹美国纽约州洛克菲勒大学基因组维护实验室，邮编10065。
²美国纽约州洛克菲勒大学基因组维护实验室，邮编：10065。电子地址：asmogorzewska@rockefeller.edu。

PMID： 29290612
预防性维修识别码： PMC6467090型
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.molcel.2017.11.035

摘要

保护和有效重启停滞的复制分支对于维持基因组完整性至关重要。在这里，我们确定了一种促进停滞的分叉从复制应激中恢复的调控途径。我们表明，必须删除哺乳动物复制体成分C20orf43/RTF2（与S.pombe RTF2同源）才能使分叉重启达到最佳状态。我们进一步证明蛋白酶体穿梭蛋白DDI1和DDI2是从停滞的叉中去除RTF2所必需的。RTF2在停滞分叉处的持续存在会导致分叉重启缺陷、DNA损伤信号的过度激活、单链DNA（ssDNA）的积累、对复制药物的敏感性和染色体不稳定性。这些结果表明，去除RTF2是细胞管理复制应激和保持基因组完整性的能力的关键决定因素。

关键词：C20或43；DDI1；DDI2；DNA复制；RTF2；蚜虫灵；羟基脲；iPOND；复制应激；泛素-蛋白酶体系统。

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数字

图1： — **图1:。蛋白酶体梭子DDI1和DDI2在复制应激反应中的作用**
(A类)人类DDI1和DDI2蛋白质示意图，突出显示其结构域。酵母Ddil含有梭状蛋白质典型的UBL和UBA结构域。人类DDI1/2缺乏UBA结构域，但具有非典型UBL结构域，可以结合泛素和蛋白酶体泛素受体。C末端泛素相互作用基序（UIM）对人类DDI2具有特异性（Nowicka等人，2015；Siva等人，2016；Trempe等人，2016）。逆转录病毒天冬氨酰蛋白酶（RVP）结构域也是DDI1/2穿梭蛋白所特有的（Sirkis等人，2006年）。(B类)蛋白酶体（RP）示意图N个、RPT型、α和β亚单位）和DNA复制蛋白，经鉴定与DTSSP交联后与DDI2相互作用。蓝色标记的是GFP-标记的DDI2下拉列表中识别的蛋白质，而非仅GFP-对照。与GFP对照IP相比，GFP-DDI2下拉框中的蛋白质至少增加了两倍。在GFP-DDI2下拉列表中，只有一个肽识别为紫色的蛋白质。图中的比率表示GFP-DDI2下拉列表中确定的肽数量与GFP中仅控制下拉列表的肽数量之比。(C类)在存在蛋白质交联剂DTSSP的情况下，在来自细胞裂解物的内源性DDI1/2的IP之后，通过蛋白质印迹验证所鉴定的相互作用的子集。蛋白质印迹的所有下拉都是在苯并酶存在的情况下进行的。(D类)显示瞬时转染DDI2 siRNAs池并由GFP-DDI1构建物稳定表达交叉补充的U2OS细胞存活率的图表，以及显示GFP-DDI 1在这些细胞中表达的western blot。用指定剂量的HU处理细胞20小时，清洗、释放，允许细胞生长7天，并进行计数。(E类)显示瞬时转染抗DDI1或对照siRNAs池并稳定表达shDDI2#1或对照shRNA的U2OS细胞存活率的图表，并辅以GFP-标记的DDI2、显示GFP-DDI2水平的western blot和相对DDI1 mRNA的图表。细胞按D处理(F类)显示瞬时转染抗DDI1的siRNAs池并稳定表达shDDI2#1的U2OS细胞存活率的图表。用2 mM HU处理细胞指定的时间，清洗、释放、生长7天并计数。(**G公司**)显示瞬时转染抗DDI1或对照siRNA池并稳定表达shDDI2#1或对照shRNA的U2OS细胞存活率的图表。用指示剂量的蚜虫灵处理细胞40小时，清洗、释放，允许生长7天，并进行计数。误差条代表3个重复的SEM。另请参见图S1

图2： — **图2:。DDI1/2介导从复制分叉中删除RTF2**
(A类)SILAC/iPOND实验的示意图，比较对照细胞和DDI1/2耗尽细胞在蚜虫双唑啉处理期间的复制叉占用。实验进行了两次，轻/重标签交换。(B类)在两个标签交换实验中，iPOND在DDI1/2共耗尽/对照细胞中识别的复制和修复蛋白中DDI-靶候选的精选列表的Log（2）比率图。达到Log（2）=1/−1的富集阈值的蛋白质以红色命名。蛋白质用平均面积定量。(C类)通过iPOND和western blot验证质谱结果。用0.4μM蚜虫灵处理细胞3 h，然后在蚜虫灵存在下用EdU标记50′。对于追逐，细胞未经蚜虫灵处理，用EdU标记10′，然后用胸腺嘧啶核苷标记50′。(D类)Western blot显示未扰动复制期间H2B、MCM7和RTF2的iPOND分析。用EdU标记U2OS细胞10′，然后进行0′、30′或60′胸苷追踪。**（E）**验证RTF2在全细胞提取物中的稳定性。对照细胞或DDI1/2共耗尽细胞用指示的抗RTF2或对照细胞的siRNA处理。误差条表示SEM n=至少3。(F类)对照细胞或DDI1/2缺失细胞中RTF2相对蛋白水平的定量。(**G公司**)对照、RTF2或DDI1/2缺失细胞中RTF2的相对mRNA水平的定量。(**H（H）**)GFP-DDI2和RTF2的免疫共沉淀。用2μM MG132处理的稳定表达GFP-DDI2 U2OS细胞，通过抗GFP或IgG对照，使用含有5 mg/ml NEM的IP缓冲液进行免疫沉淀，并对RTF2进行免疫印迹。(我)显示用指示剂量的HU处理的U2OS细胞存活率的图表。细胞被MRE11、对照或DDI1/2耗尽，RTF2被敲除或未被敲除。误差条表示SEM n=3。另请参见图S2

图3： — **图3:。DDI1/2耗竭稳定RTF2导致复制应激恢复受损**
(A类)通过20h 2mM HU处理和释放同步化后，对照细胞和DDI1/2缺失细胞的细胞周期进展分析。在指定时间点前30分钟，用BrdU标记细胞。图像是至少3个独立实验的代表。(B类)分析FACS测定的裂解caspase-3染色测定的凋亡细胞百分比。通过20 h 2 mM HU处理使U2OS对照细胞和DDI1/2缺失细胞同步化，并释放指定时间。误差条表示SEM n=3。(C类)控制单元和DDI1/2敲除单元中2 mM HU 20小时后，重新启动的分叉[重新启动的叉/（重新启动的叉子加上未重新启动的分支）]和新燃烧的起源[新燃烧的来源/（持续的叉加上新燃烧的源）]的百分比的量化。(D类)在控制单元和DDI1/2敲除单元中，在4 mM HU的4小时后，重新启动的货叉[重新启动的货叉/（重新启动的货物叉加上未重新启动的货运叉）]的百分比和货叉重新启动生产力的百分比的量化由4 mM HU的4小时之后，重新启动货叉的CldU长度与IdU长度的比值定义。(E类)在对照组和DDI1/2缺失细胞（无论是否敲除RTF2）的CldU标记期间，用0.4 uM蚜虫灵处理的连续分叉的CldU/IdU标记长度之比定义的分叉加工性分析。每个面板都包含一个实验设置示意图。误差条表示SEM n=3*方差分析表明，p<0.05**p<0.01**p<0.001***p<0.0001。参见图S3

图4： — **图4:。RTF2稳定导致的复制应激反应缺陷导致基因组不稳定性增加**
(A类)在存在低剂量HU或蚜虫精（Aph）的情况下复制后在U2OS细胞中观察到的三类中期染色体的典型例子：正常、受损和高度受损/无法计数。(B类)在对照细胞和DDI1/2缺失细胞中，在0.2 mM HU或0.4μM Aph处理40 h后，对每种类型中期的比例进行量化。(C类)U2OS对照组或DDI1/2缺失细胞中每个可计数中期的断裂数量的量化。在不处理、0.4μM蚜虫灵处理40小时或0.2 mM HU处理40小时后对细胞进行评分。(D类)定量RTF2敲除或不敲除的对照细胞或DDI1/2缺失细胞中每个可计数中期的断裂数。0.4μM蚜虫灵处理40小时后对细胞进行评分。另请参见图S4

图5： — **图5:。RTF2促进单链DNA的形成**
(A类)全细胞提取物的免疫印迹分析以评估磷酸化RPA32水平。用0.5 mM HU处理对照细胞或DDI1/2缺失细胞（无论是否敲除RTF2）20 h，释放细胞，并允许其恢复8 h。(B类)用20小时0.5 mM HU处理并用0.25%Triton-X提取的细胞中染色质结合的RPA染色的平均核强度的定量(C类)在使用或不使用Mre11抑制剂mirin的4mM HU处理5小时期间，对对照、DDI1/2缺失和BRCA2缺失细胞的新生链切除进行分析。用IdU和CldU依次标记细胞各20分钟。如果没有切除，CldU/IdU比值应为1。Western blot显示了siRNA介导的缺失后BRCA2的水平。(D类)碱性彗星实验分析DNA损伤。对照组或DDI1/2缺失细胞用0.5 mM HU处理20 h，释放，并允许恢复8 h。(E类)中性彗星实验分析DNA损伤。用0.5 mM HU、10μM ATR抑制剂VE-821或这两种药物的组合处理对照细胞或DDI1/2缺失细胞20小时(F类)Western blot显示RTF2缺失细胞在20 h 1 mM HU后磷酸化-RPA信号减少与HA:RTF2互补。(**G公司**)显示RTF2 siRNAs+/-与HA-FLAG:RTF2互补处理的细胞中相对内源性RTF2 mRNA水平的图表。qPCR引物F只识别内源性转录物的5'非翻译区。(**H（H）**)磷酸化-RPA水平相对于总RPA的定量。误差条表示SEM n=3*方差分析表明，p<0.05**p<0.01**p<0.001***p<0.0001。另请参见图S5和S6。

图6： — **图6:。复制分叉处DDI和RTF2函数的模型。**
人类RTF2与复制体同行。我们表明，当RTF2耗尽时，在复制应激条件下RPA磷酸化较少，这与复制解旋酶和聚合酶的解偶联减少一致。在生理条件下，RTF2的功能受到其DDI1/2依赖性转换的限制。在高通量检测中，小鼠和人类RTF2在体内均显示出泛素化和氨酰化。RTF2还具有假定的SUMO交互域。RTDC1的翻译后修饰对其降解是必要的，尚待确定。最终，营业额信号关闭，恢复正常复制。在缺乏功能性DDI1和DDI2的情况下，RTF2不会从应力叉中去除，过量的ssDNA积累，导致该叉的功能失活，并在复制无法完成时导致随后的基因组不稳定。

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