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.2017年12月；18(12):2131-2143.
doi:10.15252/embr.201743892。 Epub 2017年10月5日。

JMJD5在DNA损伤应激下裂解单甲基化组蛋白H3 N-尾

沈静 1, 向雪萍 1, 李汉·陈 2, 王海怡 2, 李武 2, 孙燕云 2, 李玛 三, 顾秀亭 2, 刘洪（音） 1, 王立顺 2, 余英年 1, 邵继敏 4, 朝皇 5 6, 尤金·钦 5 三 6
附属公司

JMJD5在DNA损伤应激下裂解单甲基化组蛋白H3 N-尾

景深等。 EMBO代表. 2017年12月.

摘要

组蛋白H3 N-末端蛋白结构域（N-tail）受多种翻译后修饰调控，包括甲基化、乙酰化、磷酸化和蛋白水解裂解。然而，H3 N-尾蛋白水解裂解的机制在很大程度上尚不清楚。在这里，我们报道了JMJD5，一种Jumonji C（JmjC）域蛋白，是组织蛋白酶L型蛋白酶，在引起DNA损伤反应的应激条件下介导组蛋白H3 N-尾蛋白水解裂解。JMJD5在单甲基赖氨酸（Kme1）残基的羧基侧夹住H3 N-尾。体外H3肽消化表明，JMJD5只能裂解Kme1 H3肽，而JMJD5对二甲基赖氨酸（Kme2）、三甲基赖氨酰（Kme3）或非甲基赖氨酰胺（Kme0）H3肽的裂解作用很小或没有。虽然K4、K9、K27和K36的H3 Kme1肽都可以被JMJD5裂解在体外，H3的K9是主要的解理位点体内H3.3是JMJD5裂解的主要H3靶点。在被JMJD5结合和抑制的基因启动子处，裂解被增强，这表明H3 N-尾裂解在基因表达调控中的作用。

关键词：H3K9me1；组蛋白H3；JMJD5；N‐尾部解理。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。组蛋白H3 N-尾蛋白水解的诱导与JMJD公司5应力条件下的表达式

  1. 用TdR双重阻断HeLa细胞，并将其释放到新鲜培养基中指定的时间。如图所示，用特定抗体进行蛋白质印迹。GAPDH用作蛋白质负荷控制。所示数据代表三个独立实验。

  2. 血清饥饿42小时后，将HeLa细胞释放到新鲜培养基中指定时间。用指示的H3抗体分析酸提取组蛋白。Western blot分析全细胞提取物中JMJD5的诱导作用（左面板）。右侧面板中显示的条和误差条代表平均值±SEM；n个=三个独立实验的密度分析的三分之一，用于指示JMJD5的诱导和用H3K27me2或H3 C末端抗体检测到的快速迁移带。

  3. A549细胞被TdR双重阻断，并释放到新鲜培养基中指定时间。如图所示，用特定抗体进行蛋白质印迹。所示数据代表三个独立实验。

  4. 用Myc‐JMJD5转染HeLa细胞，并进行免疫染色以显示H3K9me1、H3K9 me2、H3k9 me3或H3K27me1（红色）和异位JMJD5（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺代表10μm。灰色箭头表示转染Myc‐JMJD5的细胞。所示数据代表三个独立实验。

  5. 在用JMJD5转染的HeLa细胞中，H3 K9、K27和K36甲基化强度降低的细胞百分比绘制为平均值±SEM；n个=三个独立实验中的三个。

数据信息：红色箭头指向指示抗体检测到的快速迁移带。
图EV1
图EV1。应激条件下HeLa细胞的H3分裂

  1. HeLa细胞被血清饥饿6、12、24或42小时，然后释放到新鲜培养基中0或3小时。组蛋白H3的处理通过用抗H3 K27me1和H3 C末端区域的抗体检测全细胞提取物中快速迁移物种来证明。GAPDH被用作负荷控制。所示数据代表三个独立实验。

  2. 血清饥饿42小时后，将HeLa细胞释放到新鲜培养基中指定时间。制备全细胞提取物，并用指示的抗体进行Western blot。所示数据代表三个独立实验。

  3. （B）中JMJD5表达和H3信号强度的密度测定。所示数据以平均值±SEM表示；n个=三个独立实验中的三个。

  4. HeLa细胞按（B）处理。将细胞释放到新鲜培养基中指定的时间。制备全细胞提取物，并用指示的抗体进行Western blot。所示数据代表了两个独立的实验。

  5. 用CPT、ETO或RO‐3306处理A549细胞24小时，然后进行流式细胞术和细胞衰老分析（右）。用所示抗体对相同的细胞裂解物进行Western blot（左）。所示数据代表了两个独立的实验。

  6. 将A549细胞暴露于紫外线（40J/m2)，然后让细胞恢复18 h。用H3 C末端抗体对细胞裂解液进行Western blot，然后用H3KS抗体剥离并重新缝合相同的膜。

  7. A549细胞按照指示接受治疗。细胞裂解物与γH2AX抗体进行Western blot。

  8. 用Myc‐JMJD5转染HeLa细胞，免疫染色显示H3K9me1（红色）和异位JMJD5（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺代表10μm。灰色箭头表示转染Myc‐JMJD5的细胞。所示数据代表三个独立实验。

数据信息：（A）箭头表示检测到的主要快速迁徙物种。（B，D，E，F）红色箭头指向指示抗体检测到的快速迁移带。
图2
图2。JmjC域对于JMJD公司5二聚化和模块化H3 N‐尾对接

  1. 标有GST的JMJD5全长（FL）、螺旋N端结构域（ND）和C端JmjC结构域（CD-1）的示意图。

  2. 将细菌纯化的GST对照（模拟）、GST‐JMJD5‐FL、GST‐JMJD5‐ND或GST‐JMJD5‐CD‐1蛋白与从HeLa细胞制备的组蛋白H3孵育。分别用抗GST和抗H3 C末端抗体分析GST‐JMJD5和GST-JMJD5沉淀的H3。

  3. GST‐JMJD5‐CD1，野生型（WT）或具有不同点突变的变体，与纯化的H3组蛋白孵育。分别用抗GST和抗H3 C末端抗体分析GST‐JMJD5‐CD1沉淀物。

  4. 不同Myc‐H3变异体与Flag‐JMJD5共转染。Western blot分析抗标记免疫沉淀与抗Myc抗体的共免疫沉淀。

  5. GST‐JMJD5‐CD‐1与从转染空载体（EV）或Myc标记JMJD5（FL、CD‐l和ND）的293T细胞制备的全细胞裂解物孵育。GST‐JMJD5‐CD‐1用Ponceau S染色。GST蛋白沉淀物经过抗Myc印迹。

  6. 将A549细胞血清饥饿48小时，然后释放指定时间，然后用DMSO或1 mM BMH处理细胞1小时。用抗JMJD5抗体检测JMJD5单体和二聚体。

数据信息：所示数据代表三个独立实验。
图3
图3。JMJD公司5是用于H3 N末端切割的组织蛋白酶L型蛋白酶

  1. CTSL（2xu3）和JMJD5（4gjz）的PDB文件从RCSB蛋白质数据库下载。使用RCSB PDB蛋白质比较工具“计算结构比对”对这两种蛋白质进行结构比对。选择CTSL:146–330aa的部分催化结构域和JMJD5:305–405aa的部分JmjC结构域进行结构比较。用不同颜色标记的氨基酸意味着它们在3D结构中相互对齐。

  2. 在转染JMJD5或组织蛋白酶L1的A549细胞中，用E64处理细胞可阻断H3 N尾分裂。用指示的抗体检测到迁移速度更快的H3。

  3. 用对照（CTL）siRNA或JMJD5 siRNA-1或JMJD5siRNA-2转染A549细胞。在血清饥饿24小时后，将细胞释放到新鲜培养基中指定的时间。用所示抗体进行Western blot。

  4. 用对照siRNA或抗组织蛋白酶L、JMJD5或胰蛋白酶的siRNA转染A549细胞。用所示抗体进行Western blot。

  5. JMJD5蛋白水解处理的H3在体外细菌纯化的His‐JMJD5与从HeLa细胞纯化的组蛋白H3在含有不同化学物质的缓冲液中孵育。用所示抗体在Western blot中分析全长H3和H3裂解物种。“α‐酮”代表“α‐-酮戊二酸”。

  6. 细菌纯化的His‐JMJD5与HeLa细胞纯化的组蛋白H3培养不同时间，如（E）所示。用所示抗体在Western blot中分析全长H3和H3裂解物种。

  7. 在没有E64的情况下，在反应缓冲液中用细菌纯化的His‐JMJD5培养K9me1‐H3。在Western blot中使用抗-H3抗体（C末端）分析全长H3和H3裂解物种。

数据信息：（B–G）红色箭头指向裂解组蛋白H3。所示数据代表三个独立实验。可在线获取此图的源数据。
图EV2
图EV2。组蛋白H3是JMJD公司5剪辑活动

  1. JMJD5胰蛋白酶-1和JmjC结构域的比对。黄色表示β片，蓝色表示α螺旋结构。红色字母是序列比对中相同的氨基酸。划线氨基酸H和D是Fe+结合位点；R和K是α-酮戊二酸结合位点；K、 Y和W是组织蛋白酶L轻链样阳性基序。

  2. 在HeLa细胞中，内源性组织蛋白酶L1主要在细胞质中进行免疫染色。比例尺代表10μm。所示数据代表三个独立实验。

  3. HeLa细胞转染JMJD5 siRNA或对照siRNA；用所示抗体对细胞裂解液进行印迹。所示数据代表三个独立实验。

  4. JMJD5蛋白水解处理的H3在体外将从293T细胞纯化的Flag‐JMJD5与从HeLa细胞纯化的组蛋白H3在具有不同化学物质的缓冲液中孵育，如图所示。用所示抗体在Western blot中分析全长H3和H3裂解物种。所示数据代表三个独立实验。

  5. 细菌纯化His‐JMJD5的考马斯染色。

  6. 细菌纯化的His‐JMJD5与从HeLa细胞纯化的各种核心组蛋白孵育不同时间，如图3F所示。用所示抗体进行Western blot。

  7. 用Myc‐JMJD5转染HeLa细胞，用所示的抗体靶向所示组蛋白的C端区域对细胞裂解物进行Western blot。所示数据代表三个独立实验。

  8. HeLa细胞与指示质粒共转染，细胞裂解物与指示抗体进行Western blot。所示数据代表了两个独立的实验。

  9. 从Myc‐JMJD5转染的A549细胞中提取的染色质用所示抗体进行Western blot。所示数据代表三个独立实验。

  10. 用各种Myc标记的质粒转染HeLa细胞，并用所示抗体对细胞裂解物进行Western blot。所示数据代表了两个独立的实验。

数据信息：红色箭头指向裂解组蛋白H3。
图4
图4。JMJD公司5种主要裂解H3K9me1/2肽
  1. A–D

    JMJD5裂解H3肽的MALDI‐TOF质谱在体外所显示的数据代表了三个独立的实验。

图EV3
图EV3。JMJD公司5裂解H3Kme1肽
  1. A–C

    JMJD5裂解的H3肽的MALDI‐TOF质谱在体外所显示的数据代表了三个独立的实验。

图EV4
图EV4。消化H3肽的质谱JMJD公司5在体外
  1. A–I类

    JMJD5裂解的H3肽的MALDI‐TOF质谱在体外。所示数据代表三个独立实验。

图5
图5。JMJD公司5在K9和S10之间劈开H3

  1. EV或Myc‐JMJD5在HeLa细胞中瞬时转染，用所示的特异性H3抗体对从全细胞裂解物中获得的H3进行Western blot分析。

  2. HA标记的WT、K4R、K9R和S10A突变型H3在293T细胞中与Myc‐JMJD5共转染或不转染。在Western blot中用抗HA抗体检测H3‐HA。用抗Myc抗体印迹Myc免疫沉淀物，以显示Myc‐JMJD5的表达。

  3. 如图所示，用JMJD5的不同结构域或突变体瞬时转染HeLa细胞。用指示的H3抗体对全细胞裂解物进行Western blotting分析。红色星号表示载体表达的相应蛋白质。

  4. 随着Myc‐JMJD5‐ND数量的增加，在HeLa细胞中检测到JMJD5∙ND形式对H3分裂的显性负效应。从这些细胞中提取的蛋白质用Western blot中显示的H3抗体进行分析。

  5. 在A549细胞中瞬时转染全长JMJD5和JMJD5的一系列结构域缺失构建物。如上所述制备组蛋白，并用抗H3K27me2抗体进行印迹。用抗Myc抗体印迹JMDJ5。红色星号表示载体表达的相应蛋白质。

数据信息：红色箭头指向裂解组蛋白H3。所示数据代表三个独立实验。
图EV5
图EV5。JMJD公司5诱导培养细胞中H3 N‐尾分裂

  1. 在瞬时转染EV（mock）或Myc‐JMJD5的HeLa细胞中，用所示抗体通过Western blot分析酸提取的H3和H3快速迁移物种。所示数据代表三个独立实验。

  2. 在瞬时转染或不转染Myc‐JMJD5的肺癌细胞系A549中，制备全细胞裂解物，用所示抗体进行Western blot分析。所示数据代表三个独立实验。

  3. 使用对应于H3 N末端1–20aa或10–28aa的H3肽，通过ELISA测定H3KS抗体特异性（左图）。将C末端标记的全长H3或H3Δ1-9（氨基酸1-9被删除）的表达载体转染至293T细胞。用Flag或H3KS抗体对细胞裂解物进行印迹（右图）。

  4. 一系列Myc标记的JMJD5域删除构造的示意图。

数据信息：（A和B）红色箭头指向裂解组蛋白H3。所示数据代表三个独立实验。
图6
图6。裂解活性JMJD公司5调节N尾依赖性基因转录

  1. 在瞬时转染JMJD5‐FL（左上面板）或JMJD5­ND（右上面板）的A549细胞中，通过实时PCR分析所示基因的mRNA表达。单个基因的值被归一化为β-actin。所示数据代表平均值±SEM；n个=三个独立实验中的三个。使用抗Myc抗体分析上述样本中的一个代表性全长JMJD5或JMJD5‐ND蛋白表达（下表）。

  2. 用JMJD5‐FL或JMJD5­ND瞬时转染A549细胞，并通过ChIP分析检测所示基因启动子区上H3K9me1或H3K9 me3的水平。IgG用作阴性对照。所示数据代表三个独立实验。

  3. 用Flag‐JMJD5瞬时转染A549细胞。使用指示的抗体和引物对指示基因的启动子区域进行ChIP分析。IgG用作阴性对照。所示数据代表平均值±SEM；n个=三个独立实验中的三个*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.P（P）值由单尾配对学生的t吨使用Microsoft Excel进行测试。

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