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.2017年4月3日；16(7):673-684.

doi:10.1080/15384101.2017.1295179。 Epub 2017年2月22日。

招募到紫外线损伤位点的错配修复蛋白导致G1期许可因子Cdt1降解

田中美由纪夫¹, 高原美雄¹, 努基纳科平¹, Akiyo Hayashi先生¹, Wataru Sakai公司², Kaoru Sugasawa公司², Yasushi Shiomi先生¹, 西谷秀夫¹

附属公司

PMID： 28278049
预防性维修识别码：项目编号5397274
内政部： 10.1080/15384101.2017.1295179

招募到紫外线损伤位点的错配修复蛋白导致G1期许可因子Cdt1降解

田中美由纪夫等。细胞周期. 2017.

.2017年4月3日；16(7):673-684.

doi:10.1080/15384101.2017.1295179。 Epub 2017年2月22日。

作者

田中美由纪夫¹, 高原美雄¹, Kohei Nukina公司¹, Akiyo Hayashi先生¹, Wataru Sakai公司², Kaoru Sugasawa公司², Yasushi Shiomi先生¹, 西谷秀夫¹

附属公司

¹兵库大学生命科学研究生院。
²b日本兵库县神户市神户大学生物信号研究中心。

PMID： 28278049
预防性维修识别码：项目编号5397274
内政部： 10.1080/15384101.2017.1295179

摘要

Cdt1被CRL4迅速降解^抄送2紫外线照射后的E3泛素连接酶。先前的报道表明，核苷酸切除修复（NER）途径是导致Cdt1蛋白快速降解的原因。这里，我们表明错配修复（MMR）蛋白也参与了紫外线照射后G1期Cdt1的降解。首先，与正常成纤维细胞中Cdt1的快速降解（约15分钟内）相比，在NER缺乏的XP-A细胞中，Cdt1在约30分钟内保持稳定，但在约60分钟内降解。延迟降解也依赖于PCNA和CRL4^抄送2MMR蛋白Msh2和Msh6被招募到G1期XP-A细胞的紫外线损伤部位。用小干扰RNA耗尽这些因子可以阻止XP-A细胞中Cdt1的降解。与XP-A细胞的发现类似，XPA的缺失延迟了正常成纤维细胞和U2OS细胞中Cdt1的降解，Msh6的共同缺失进一步阻止了Cdt1降解。此外，仅Msh6的缺失就延迟了这两种细胞类型中Cdt1的降解。当Cdt1的高表达减弱了Cdt1降解时，受损部位的修复合成受到抑制。我们的研究结果表明，紫外线照射可诱导激活CRL4的多种修复途径^抄送2在细胞周期的G1期降解其靶蛋白，从而有效修复DNA损伤。

关键词：CRL4Cdt2；Cdt1；不匹配修复（MMR）；PCNA；紫外线。

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数字

图1。 — 图1。
紫外线照射后XP-A细胞中Cdt1的降解被延迟，并且它还依赖于PCNA和CRL4^抄送2（A）以5 J/m的紫外线照射正常成纤维细胞（NF）和XP-A细胞²并在指定的时间点收集进行Western blotting。RCC1被用作负荷控制。（B）将盖玻片上生长的细胞照如（A）所示进行照射，并用Cdt1和Cyclin A（CyA）抗体进行染色。在指定的时间点对Cdt1（+）或Cyclin A（+）阳性的细胞进行计数，并绘制NF和XP-A细胞的频率（%）。（C）对XP-A细胞和补充野生型XPA基因（wtXPA）的XP-A电池进行紫外线照射（5 J/m²)并在指定的时间点收集进行Western blotting（左侧面板）。紫外线照射后XP-A、XP-A（wtXOA）和NF中Cdt1降解的时间过程比较（右面板；显示了3个独立实验的平均值和标准偏差）。（D）XP-A细胞中延迟的Cdt1的降解也依赖于CRL4介导的泛素蛋白酶体途径^抄送2将NF或XP-A细胞与MG132一起孵育，10分钟后用5J/m的UV照射²并在指定的时间点（min）收集进行Western blotting（左上面板）。用所示的siRNA转染细胞培养物两次，共培养3天。细胞以5 J/m的紫外线照射²并在指定的时间点（min）收集进行Western blotting。测量了Cdt1蛋白水平，并显示了其相对量（归一化为RCC1）。使用用于荧光素酶的siRNA作为对照（siLuc）。星号表示非特定带。

图2。 — 图2。
PCNA、Cdt2和Cdt1在XP-A细胞的紫外线照射部位积聚，但在正常成纤维细胞中积聚较晚。（A）非同步生长的正常成纤维细胞（NF）和XP-A细胞被一层5μm孔的膜覆盖，局部用紫外线照射（100 J/m²; 微孔分析），并培养指定时间。细胞固定并用CPD和PCNA抗体染色。棒材，10μm。UV（-）中的白色三角形表示S相细胞（见正文）。（B）使用ImageJ在CPD点测量PCNA强度，如（A）所示（每个时间点>25个点），并绘制平均值（任意）。（C）将异步生长的NF、XP-A和XP-A（wtXPA）细胞作为（A）处理，培养30分钟，并用CPD和PCNA抗体染色。（D）使用ImageJ（30个点/细胞株）测量（C）中CPD部位的PCNA强度，并显示平均值（任意）。（E）异步生长的细胞按（A）中的方法处理，并用CPD和Cdt1抗体染色。为了可视化Cdt1蛋白，在紫外线照射前10分钟将MG132添加到培养基中。棒材，5μm。在CPD部位检测细胞的Cdt1染色（每个时间点>100个位点），Cdt1阳性位点的频率显示为（%）（左侧面板）。还测量了细胞的Cdt1强度，并显示了平均值（任意）（右图）。

图3。 — 图3。
Msh2和Msh6蛋白被招募到XP-A细胞中的紫外线照射位点。（A）同步于G1期的细胞通过具有5-μm孔的膜局部照射（+）或不照射（-）。细胞孵育1 h，预提取，并用CPD和Msh2或Msh6抗体固定。（B）在CPD部位检测细胞Msh2或Msh6染色。显示了Msh2或Msh6阳性的CPD位点的频率（%）（检查了>100个CPD位点）。（C）如（A）中所述处理的XP-A细胞与Msh2和PCNA共同染色。92.5%的CPD位点Msh2阳性（62/67个CPD位点）。（D）同步于G1期的细胞用紫外线（+）局部照射，并在指定的时间点用CPD和Msh2抗体染色。（−）：未经紫外线照射。检测细胞CPD和Msh2，绘制细胞与CPD和Msh2共染的频率。棒材，5μm。

图4。 — 图4。
MMR参与XP-A细胞中Cdt1的降解。（A） XP-A细胞转染两次Ape1、Msh2、Msh6或荧光素酶（siLuc）的siRNA作为对照。三天后，一半的细胞培养物用5 J/m的紫外线照射²并在指定的时间段内孵化。在指定的时间点收集细胞，用Cdt1、Msh2、Msh6、Ape1和RCC1的抗体进行蛋白质印迹。测量Cdt1蛋白水平并显示其相对量。（B） XP-A细胞按（A）处理，并用Cdt1和Cyclin A（CyA）抗体固定和染色。检测细胞进行Cdt1染色，显示Cdt1阳性细胞的频率（%）。棒材，10μm。

图5。 — 图5。
MMR参与正常细胞中Cdt1的降解。（A）正常成纤维细胞（NF）转染所示的siRNA，3天后，紫外线照射（25 J/m²)并在指定的时间点收集。用Mcm6蛋白对Cdt1蛋白水平进行标准化，并显示了3个独立实验的平均值和标准偏差。（B） U2OS细胞按（A）处理并进行分析。（显示了3个独立实验的平均值和标准偏差）。（C） Cdt2–3xFLAG与MMR蛋白的相互作用。分离出Cdt2–3xFLAG–表达稳定的U2OS细胞，并用Cdt2抗体进行Western blotting检测Cdt2-3xFLAG（3xFLAG-）和内源性Cdt2（end.）的表达水平。用MG132处理U2OS细胞和表达Cdt2–3xFLAG的U2OS电池10分钟，并用紫外线照射（25 J/m²)（+）或不（−）。培养30分钟后，收集细胞，用多聚甲醛固定，并用材料和方法中描述的抗FLAG免疫沉淀。对沉淀中的指示蛋白质进行了检测。测量Msh2、Mas6和PCNA的带强度，并将其归一化为UV（−）。显示了Mas2和Mas6的3个独立实验的平均值和标准偏差。对于PCNA，显示了两次独立分析的平均值。星号表示用抗Cdt2抗体重新绘制后，Msh2条带仍然存在。

图6。 — 图6。
Cdt1降解对DNA修复合成非常重要。（A） HeLa细胞仅转染Cdt1（1–101）-Cy-9myc或9myc。第二天，用紫外线局部照射细胞，在EdU存在下孵育30分钟，并用myc和Alexa Fluor 488叠氮化物抗体固定以检测制造商提供的EdU。开放箭头表示EdU染色较低的Cdt1（1–101）-Cy-9myc表达细胞，而填充箭头表示只有9myc的表达细胞带有EdU斑点信号。（B）检测（A）中EdU斑点阳性细胞是否表达Cdt1（1–101）-Cy-9myc（Cdt1-Cy）或仅9myc，并显示每个转染细胞培养物中不表达（蓝色）或不表达（红色）细胞的频率（%）。显示了两次独立分析的平均值。（C）如A中所述对HeLa细胞进行处理，并对EdU和CPD进行染色。开放箭头表示具有低或负EdU信号的CPD站点。（D）检测（C）中CPD斑点阳性细胞的EdU掺入情况，并显示每个转染细胞培养物中EdU阳性（+；绿色）或阴性或低（-；白色）细胞的频率（%）。显示了两次独立分析的平均值。

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中的注释

失配修复调节紫外线损伤后的Cdt1。
Panagopoulos A、Taraviras S、Lygerou Z。 Panagopoulos A等人。细胞周期。2017年6月18日；16(12):1143-1144. doi:10.1080/15384101.2017.1319687。细胞周期。2017 PMID：28426347 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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