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.2017年1月24日；114（4）：E524-E533。
doi:10.1073/pnas.1614336114。 Epub 2017年1月9日。

ALCAM在神经炎症和血脑屏障稳态中的双重作用

马克·安德雷·勒库耶 1, 奥利维娅·圣洛伦特 1, 林恩·波波尼埃 1, 桑德拉·拉鲁什 1, 凯瑟琳·拉罗谢尔 1, 劳雷·米歇尔 1, 马克·查拉巴蒂 1, 迈克尔·阿巴迪耶 2, 斯蒂芬妮·赞迪 1, 内达·哈格耶赫·贾罗米 2, 伊丽莎白·高英 1, 卡米尔·皮特 1, 鲁思·莱克 2, 布丽塔·恩格尔哈特 2, 亚历山大·普拉特 三 4
附属公司

ALCAM在神经炎症和血脑屏障稳态中的双重作用

马克·安德雷·勒库耶等。 美国国家科学院程序. .

摘要

活化的白细胞粘附分子（ALCAM）是一种在血脑屏障内皮细胞（BBB-EC）上发现的细胞粘附分子，先前已证明其参与白细胞在内皮细胞间的迁移。在本研究中，我们发现ALCAM敲除（KO）小鼠产生了一种更严重的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）三5-55-诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。与WT对照组相比，病情加重与CNS浸润的促炎性白细胞数量显著增加有关。被动EAE转移实验表明，在主动EAE中观察到的病理生理学与BBB-EC上缺乏ALCAM有关。此外，未免疫的ALCAM KO小鼠的表型特征显示BBB连接蛋白的表达降低。进一步的体内、体外和分子分析证实，ALCAM与BBB处的紧密连接分子组装有关，解释了ALCAM KO动物CNS血管通透性增加的原因。总的来说，我们的数据表明ALCAM在维持BBB完整性方面具有重要的生物学功能。

关键词：ALCAM；EAE；血脑屏障；多发性硬化；紧密连接。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
ALCAM在BBB和免疫细胞上的表达。(A类)通过Western blot（肌动蛋白，对照蛋白）检测新分离的WT和ALCAM KO小鼠脑和脊髓血管中ALCAM的表达。数据代表了n个=5个独立实验。(B)RT-PCR分析美国资产负债管理委员会从WT和ALCAM KO小鼠的小鼠BBB-EC（MBECs）原代培养中获得的mRNA，这些小鼠处于静息状态（Ctrl）或接受TNF和IFNγ治疗（Stim，受刺激）。数据代表了n个=2个独立实验。(C类)通过流式细胞术评估从WT和ALCAM KO小鼠获得的MBEC原代培养物上ALCAM和PECAM-1的表达。数据代表了n个=5个独立实验。(D类)ALCAM在体外CD4上的表达+从CNS和CD11b中分离的T淋巴细胞+单核细胞/巨噬细胞和CD11b+CD11c公司+在活动性EAE的早期症状阶段，从ALCAM KO小鼠或其WT同胞的脾细胞中分离出的树突状细胞。数据代表了n个=3个独立实验。
图2。
图2。
ALCAM KO小鼠出现更严重的活性EAE。(A类)MOG的平均累积临床EAE得分35–55–免疫C57BL/6 WT和ALCAM KO小鼠。显示的数据是每组40只小鼠的平均值±SEMn个=12个独立实验。从脾脏和淋巴结分离出的免疫细胞的绝对数量(B)或来自CNS(C类)WT和ALCAM KO小鼠在EAE的不同dpi下。所示数据为每个时间点3-12只动物的平均值±SEM，代表n个=8个独立实验。(D类)表达CD4的IFNγ、IL-17或IFNγ和IL-17的百分比+和CD8+流式细胞术检测WT和ALCAM KO小鼠在EAE不同dpi时CNS中分离的T淋巴细胞。显示的数据是每个时间点3-5只动物的平均值±SEM，代表n个=5个独立实验。(E类)CD4绝对数+CD25型+FOXP3公司+流式细胞术检测EAE不同dpi时ALCAM KO和WT小鼠中枢神经系统浸润的调节性T淋巴细胞。显示的数据是每个时间点3-6只动物的平均值±SEM，代表n个=3个独立实验。(F类)流式细胞术通过CD11b、CD43、CD206、Ly6C、IL-10和IL-12的表达评估在EAE的不同dpi下，从WT和ALCAM KO小鼠的CNS中分离出的M1单核细胞/巨噬细胞相对于M2亚型的患病率。显示的数据是三个独立实验中每个时间点4–10只动物的平均值±SEM。(G公司)在EAE诱导后第12天，对ALCAM KO和WT小鼠脊髓切片中的层粘连蛋白（绿色）、TOPRO-3（细胞核，蓝色）和CD4或F4/80（红色）进行免疫荧光染色。（比例尺，100µm）所示图像代表每只动物的九个部分，代表n个=每组4只动物。(H（H）)CD4绝对数+T淋巴细胞和F4/80+每个损伤处观察到巨噬细胞。n个=每组从三只动物中评估10-15个病灶*P（P）≤ 0.05, ***P（P）≤ 0.001.
图S1。
图S1。
的表达式(A类)ALCAM和(B)静止记忆CD4上的CD6+流式细胞术评估从原始WT脾细胞分离的T淋巴细胞。ALCAM（蓝色）或CD6（蓝色）及其各自的同种型对照（灰色）的平均荧光强度。(C类)幼年ALCAM KO小鼠及其WT胎鼠脾脏、LN和胸腺中白细胞的绝对数量。脾淋巴细胞分离百分比(D类)、LN(E类)胸腺(F类)和CNS(G公司)流式细胞术检测细胞外标志物CD3、CD4、CD8和CD44阳性的幼年ALCAM KO和WT小鼠。CD4的百分比+和CD8+细胞在CD3上被选通+T淋巴细胞。CD44的百分比+细胞在CD4上被门控+或CD8+T淋巴细胞。显示的数据是每个时间点3-9只动物的平均值±SEM。CD4的百分比+或CD8+从脾脏分离的T淋巴细胞(H（H）)、LN(我)和胸腺(J型)通过流式细胞术评估，表达细胞因子IFNγ和/或IL-17的幼稚ALCAM KO和WT小鼠。显示的数据是每个时间点3-9只动物的平均值±SEM。
图S2。
图S2。
(A类)重组人MOG免疫C57BL/6 WT和ALCAM KO小鼠的平均累积临床EAE评分。显示的数据是每组42只WT和45只ALCAM KO小鼠的平均值±SEM，是n个=3个独立实验。AUC：重量，54.88±2.29；ALCAM KO，64.07±2.59*P（P）≤ 0.05. (B)CD4百分比+或CD8+从ALCAM KO和WT小鼠脾脏和LNs中分离的T淋巴细胞在–MOG后不同时间点表达IFNγ和/或IL-1735–55诱导活性EAE。显示的数据是每个时间点三只动物的平均值±SEM。
图3。
图3。
BBB-EC上缺乏ALCAM会增加EAE疾病的严重程度。(A类)通过流式细胞术评估在静息或刺激（刺激；TNF和IFNγ）条件下从WT和ALCAM KO小鼠分离的MBEC原代培养物上CAMs（ALCAM、PECAM-1、ICAM-1、VCAM-1、ICAM-2和CD34）的表达。n个=使用四种原代培养物的4个独立实验。(B)用MOG过继转移的WT和ALCAM KO小鼠的平均累积EAE临床评分35–55–重新激活WT脾细胞。所示数据代表n个=3个独立实验，每组20只动物。(C–E类)过继转移EAE实验中WT或ALCAM KO动物中枢神经系统浸润免疫细胞的特征，转移后12天（如所示B). (C类)从受体小鼠的中枢神经系统分离出的免疫细胞的绝对数量。(D类和E类)表达表面标记CD4、CD11b、CD11c和CD8的CNS浸润免疫细胞的百分比以及ALCAM的百分比+、CD44hi、干扰素γ+和IL-17+在前面的表面标记上选通的细胞。显示的数据是每组3-4只动物的平均值±SEM，代表了三个转移实验。(F类)用MOG过继转移的WT和ALCAM KO小鼠的平均累积EAE临床评分35–55–重新激活ALCAM KO脾细胞。所示数据代表n个=3个独立实验，每组26只WT和20只ALCAM KO小鼠。(G–I型)移植后12天过继移植EAE实验中浸润WT或ALCAM KO动物中枢神经系统的免疫细胞特征（如所示F类). (G公司)从受体小鼠的中枢神经系统分离出的免疫细胞的绝对数量。(H（H）和我)表达表面标记CD4、CD11b、CD11c和CD8的CNS浸润免疫细胞的百分比以及ALCAM的百分比+、CD44hi、干扰素γ+和IL-17+在前面的表面标记上选通的细胞。显示的数据是每组四只动物的平均值±SEM，以及三个转移实验的代表性数据*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01, ***P（P）≤ 0.001.
图S3。
图S3。
粘附分子CD62E、Ninjurin-1和MCAM在从WT和ALCAM KO小鼠分离的MBEC原代培养物上的表达，用TNF和IFNγ（刺激）刺激或在静息状态下，通过流式细胞术进行评估。所示数据为平均值±SEMn个=使用四种原代培养物的4个独立实验*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01.
图4。
图4。
ALCAM KO小鼠表现出TJ分子的紊乱，这转化为内皮细胞通透性的增加。(A类)从WT或ALCAM KO小鼠分离的pMBMEC融合单层的TEER值，相对于WT值表达（1.0）。所示数据为三次进行的七个独立实验的平均值±SEM。(B)10-kDa右旋糖酐和BSA在体外通过未经治疗或经TNF和IFNγ治疗的WT或ALCAM KO小鼠MBEC单层的渗透系数（刺激）。所示数据是每个条件下3-4个重复的平均值±SEM，代表n个=3个独立实验。(C类)在WT和ALCAM KO小鼠EAE期间的不同时间点通过静脉注射荧光标记的右旋糖酐（3和20 kDa）实现体内BBB通透性。数据以血液荧光强度的百分比表示，并通过荧光分光光度计进行测量。所示数据为每个条件下5–15次重复的平均值±SEMn个=3个独立实验。(D类)闭塞素免疫荧光染色（红色；左侧)，α-catenin（绿色；居中)和ZO-1（红色；赖特)在幼稚ALCAM KO和WT小鼠的脊髓切片中。细胞核，蓝色。（比例尺，20µm）数据代表每只动物和n个=每组4只动物。(E类)通过共焦显微镜评估原始ALCAM KO和WT脊髓切片中结合分子的最大像素强度分析。n个=每组25–65条血管。(F类)MBEC原代培养中结合分子的最大像素强度分析。n个=每组160–260个细胞结*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01, ***P（P）≤ 0.001.
图S4。
图S4。
(A类)ALCAM KO的免疫荧光图像(顶部)和WT(底部)脑白质(左侧)和浸润脑膜周围的脑实质组织(赖特). 组织切片染色GFAP（红色）、泛蓝（绿色）和细胞核（蓝色）。（比例尺，15µm）数据代表每只动物的四个截面。(B)ALCAM KO的免疫荧光图像(顶部)和WT(底部)脑周边脑膜(左侧)，浸润脑膜周围的脑实质组织(居中)和脑白质(赖特). 组织切片染色以检测小鼠IgG（红色）、泛蓝蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。（比例尺，15µm）数据代表每只动物的四个截面。(C类)ALCAM KO的免疫荧光图像(顶部)和WT(底部)脑周边脑膜(左侧)和脑白质(赖特). 组织切片染色纤维蛋白原（绿色）、P120（红色）和细胞核（蓝色）。（比例尺，15µm）数据代表每只动物的四个截面。
图5。
图5。
ALCAM直接或间接与TJ绑定。(A类)Western blot检测MBEC全细胞裂解物、非特异性山羊IgG对照免疫沉淀和ALCAM免疫沉淀（IP）样品中ALCAM蛋白的表达。(B)ALCAM下拉裂解物上ZO-2（亚型±160 kDa）、扣带蛋白（160 kDa）、TARA（68 kDa(居中)，对应的MBEC总细胞裂解物(左侧)和控制IP(赖特).
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