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.2016年5月17日；17(6):333-51.
doi:10.1038/nrg.2016.49。

成熟：下一代测序技术十年

萨拉·古德温 1, 约翰·德·麦克弗森 2, W理查德·麦康比 1
附属公司
审查

成熟：下一代测序技术十年

萨拉·古德温等。 Nat Rev基因. .

摘要

自2003年人类基因组项目完成以来，基因组测序技术取得了非凡的进展，这导致每兆基的成本降低，测序基因组的数量和多样性增加。基因组结构的惊人复杂性已经被揭示，这使得这些测序技术有了更大的进步。一些方法在最短的时间内最大限度地增加了测序的碱基数量，产生了丰富的数据，可用于理解日益复杂的表型。另一种方法是，其他方法现在的目标是测序较长的连续DNA片段，这对于解析结构复杂的区域至关重要。这些和其他策略为研究人员和临床医生提供了多种工具，以更深入地探测基因组，从而加深了对基因组序列变异如何成为表型和疾病的基础的理解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益声明

作者声明了相互竞争的利益：参见Web版本了解详细信息。

数字

图1|
图1|。模板放大策略。
一|在乳液PCR中，片段DNA模板与适配器序列连接，并与覆盖有互补适配器、脱氧核苷酸（dNTP）、引物和DNA聚合酶的珠一起捕获在水滴（胶束）中。PCR是在胶束内进行的，用相同DNA序列的数千个拷贝覆盖每个珠子。b|在固相桥扩增中，片段DNA连接到适配器序列，并结合到固定在固体载体上的引物上，例如有图案的流动细胞。自由端可以与附近的其他引物相互作用，形成桥结构。PCR用于从固定化引物中产生第二条链，并去除未结合的DNA。c（c）|在固相模板行走中，片段DNA被连接到适配器上，并与附着在固体载体上的互补引物结合。PCR用于生成第二条链。现在的双链模板部分变性，使原始模板的自由端漂移并结合到另一个附近的引物序列。反向引物用于启动链置换以生成额外的自由模板，每个模板都可以与新的引物结合。d日|在DNA纳米球生成过程中，DNA片段化并连接到四个适配器序列中的第一个。模板被放大、循环并用II型内切酶切割。加入第二组适配器，然后进行扩增、环化和切割。对其余两个适配器重复此过程。最终产品是一个带有四个适配器的圆形模板，每个适配器由一个模板序列分隔。文库分子经历了一个滚动的圆周放大步骤，产生了大量称为DNA纳米球的级联体，然后将其沉积在流动细胞上。部分一和b改编自自然出版集团参考文献。
图2|
图2|。通过连接方法测序。
一|SOLiD测序。在簇生成或珠沉积到载玻片上后，通过连接对片段进行测序，在DNA文库中添加荧光标记的双碱基编码探针，该探针由第一和第二位置的已知核苷酸（深蓝色）组成，然后是简并或通用碱基（粉红色）。将双基探针连接到与适配器（红色）互补的锚（浅紫色）上，并对幻灯片进行成像，以识别每个片段中的前两个碱基。未延伸的股被未标记的探针或磷酸酶覆盖，以保持周期同步。最后，将末端简并碱基和荧光团从探针上切割下来，留下一个5 bp的延伸片段。该过程重复十次，直到每五个碱基中有两个被识别出来。此时，通过移除所有结扎的探针重置整个链，并将探针绑定、结扎、成像和切割过程重复四次，每次使用n+1、n+2、n+3或n+4偏置锚。b|完整基因组学。使用组合探针-锚连接（cPAL）方法对DNA进行测序。DNA纳米球沉积后，与四个适配器序列之一互补的锚和荧光标记探针被绑定到每个纳米球。除第一个位置外，探针完全退化。然后将锚和探针连接到位并成像，以识别锚3′或5′侧的第一个基座。接下来，删除探针-锚复合体，该过程再次开始，使用相同的锚，但在n+1位置具有已知底座的不同探针。重复此操作，直到从锚的3′端识别出五个底座，从锚的5′端识别五个底座。另一轮杂交发生了，这一次使用具有五个碱基偏移的锚来识别锚任一侧的额外五个碱位。最后，对nanoball中剩下的三个适配器序列中的每一个重复整个过程，生成100 bp的成对读取。
图3|
图3|。合成测序：循环可逆终止方法。
一|伊鲁米纳。固相模板富集后，将引物、DNA聚合酶和修饰核苷酸的混合物添加到流动细胞中。每个核苷酸被3′阻断-O（运行）-叠氮甲基，并用碱基特异性可裂解荧光团（F）标记。在每个循环中，每个簇中的片段将只包含一个核苷酸，因为封闭的3′组阻止了额外的合并。碱合并后，未合并的碱被冲走，并使用两个或四个激光通道通过全内反射荧光（TIRF）显微镜对载玻片进行成像；颜色（或NextSeq使用的双通道系统中缺少或混合颜色）确定了每个簇中包含的碱基。然后将染料裂解，并使用还原剂三（2-羧乙基）膦（TCEP）再生3′-OH。核苷酸添加、延伸和切割的循环可以再次开始。b|齐亚根。在基于珠的模板富集后，将引物、DNA聚合酶和修饰核苷酸的混合物添加到流动细胞中。每个核苷酸被3′阻断-O（运行）-烯丙基和一些碱基用碱基特异性的可裂解荧光团标记。底座合并后，未合并的底座被冲走，幻灯片由TIRF使用四个激光通道成像。然后对染料进行裂解，并使用钯和P（PhSO）的还原剂混合物再生3′-OH三钠）三（TPPTS）。
图4|
图4|。合成测序：单核苷酸加成方法。
一|454焦磷酸测序。在基于珠子的模板富集后，将珠子与引物和含有酶混合物的不同珠子一起排列在微量平板上。在第一个周期中，将一个单核苷酸物种添加到板中，每个互补碱基通过DNA聚合酶并入新合成的链中。该反应的副产物是焦磷酸分子（PP我). PP公司我该分子和ATP硫酰化酶一起将腺苷5′磷酸硫酸盐（APS）转化为ATP。ATP又是荧光素酶将荧光素转化为氧化荧光素的辅因子，其副产物是光。最后，使用apyrase降解任何未合并的碱，并将下一个碱添加到井中。由电荷耦合器件（CCD）相机检测到的每一束光都可以归因于在特定珠上加入一个或多个碱基。b|离子激流。在基于珠子的模板富集后，珠子被小心地排列成微量板，其中一个珠子占据一个反应井。一次向微孔中添加一种核苷酸，并进行标准延伸反应。随着每个碱基的结合，单个H+离子是作为副产品产生的。H+释放导致pH值发生0.02单位的变化，由集成互补金属氧化物半导体（CMOS）和离子敏感场效应晶体管（ISFET）器件检测到。引入单核苷酸物种后，未合并的碱基被冲走，然后添加下一个碱基。部分一改编自自然出版集团参考文献。
图5|
图5|。实时和合成长读测序方法。
A类|实时长读测序平台。澳大利亚|太平洋生物科学公司（PacBio）的单分子实时（SMRT）测序。模板片段经过处理并连接到两端的发夹适配器上，形成一个圆形DNA分子，两端具有恒定的单链DNA（ssDNA）区域，中间是双链DNA（dsDNA）模板。生成的“SMRTbell”模板经过大小选择协议，其中删除过大或过小的片段，以确保高效测序。引物和有效的φ29 DNA聚合酶附着在SMRTbell的ssDNA区域。然后将准备好的库添加到零模波导（ZMW）SMRT单元中，在那里可以进行测序。为了可视化测序，添加了标记核苷酸的混合物；由于聚合酶结合DNA文库位于SMRT细胞中的一个孔中，聚合酶将荧光标记的核苷酸合并到一条伸长的DNA链中。在合并过程中，核苷酸通过ZMW底部聚合酶的活性短暂停顿，该聚合酶由摄像机监控。抗体|牛津纳米孔技术公司（ONT）。DNA最初片段为8-10 kb。两个不同的适配器，一个先导和一个发夹，连接到片段dsDNA的两端。目前，还没有方法将适配器定向到DNA分子的特定末端，因此有三种可能的库构象：先导-先导、先导-发夹和发夹-发夹。先导适配器是一种双链适配器，包含将DNA导入孔所需的序列和帮助将DNA导入膜表面的系链序列。没有这个先导适配器，DNA与毛孔的相互作用极小，这会阻止任何发夹-发夹片段被测序。理想的图书馆结构是领头人-发夹。在这种构象中，先导序列将DNA片段导向通过电流的孔。当DNA通过孔移位时，观察到通过孔的电压发生了特征性变化。记录了各种参数，包括偏移的幅度和持续时间，可以解释为特定的k-mer序列。当下一个碱基进入孔中时，一个新的k-mer调节电压并被识别。在发夹处，DNA继续通过孔适配器转移到补体链上。这允许使用正向和反向股来创建一个称为“2D”读取的一致序列。B|合成长读测序平台。文学士|伊鲁米纳。基因组DNA模板被片段化为8-10 kb的片段。然后将它们分割成一个微量板，这样在一个井中大约有3000个模板。在板内，每个片段被剪切到大约350 bp，并用每个孔的单个条形码进行条形码。然后，DNA可以被汇集并通过标准的短读管道发送。Bb公司|10X Genomics基于乳液的测序。只要1 ng的起始材料，GemCode就可以将任意大的DNA片段（约100 kb）与含有适配器和条形码序列的凝胶珠一起分割成胶束（也称为“GEM”）。创业板通常包含约0.3倍的基因组拷贝和750000个唯一条形码。在每个创业板中，凝胶珠溶解，从原始的大片段中扩增出较小的DNA片段，每个片段都带有识别源创业板的条形码。测序后，将读取的数据对齐并链接在一起，形成一系列跨越约50 kb的锚定片段。与Illumina系统不同的是，这种方法并不试图获得单个DNA片段的完整端到端覆盖。相反，来自单个GEM的读取分散在原始DNA片段上，并且累积覆盖率来自多个具有分散但链接读取的GEM。部分澳大利亚改编自自然出版集团REF。部分文学士改编自REF。
无
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    1. Wetterstrand KA DNA测序成本：来自NHGRI基因组测序计划（GSP）的数据。国家人类基因组研究所；[在线]，http://www.genome.gov/sequencingcosts网站（2016年1月15日更新）。
    1. Kircher M&Kelso J高通量DNA测序-概念和局限性。《生物论文》32，524–536（2010）。-公共医学
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