Extracellular matrix remodelling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins

doi:10.1093/cvr/cvw075

.2016年6月1日；110(3):419-30.

doi:10.1093/cvr/cvw075。 Epub 2016年4月11日。

静脉高压引起的细胞外基质重塑：人类静脉曲张的蛋白质组学

附属公司

¹英国伦敦国王学院国王英国心脏基金会中心，125 Coldharbour Lane，London SE5 9NU，UK。
²美国亚利桑那州斯科茨代尔市梅奥诊所血管和介入放射科。
^三英国皇家心脏基金会中心，伦敦国王学院，125 Coldharbour Lane，London SE5 9NU，UK St George’s Hospital，NHS Trust，Londom，UK。
⁴美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院血管外科。
⁵英国伦敦NHS信托圣乔治医院。
⁶英国利兹大学心血管和代谢医学研究所。
⁷美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所血管和介入放射科。
⁸英国SE5 9NU伦敦Coldharbour巷125号伦敦国王学院国王英国心脏基金会中心manuel.mayr@kcl.ac.uk。

PMID： 27068509
预防性维修识别码：项目经理4872879
内政部： 10.1093/cvr/cvw075

静脉高压引起的细胞外基质重塑：人类静脉曲张的蛋白质组学

哈维尔·巴拉洛布雷·巴雷罗等。心血管研究. 2016.

.2016年6月1日；110(3):419-30.

doi:10.1093/cvr/cvw075。 Epub 2016年4月11日。

附属公司

¹英国伦敦国王学院国王英国心脏基金会中心，125 Coldharbour Lane，London SE5 9NU，UK。
²美国亚利桑那州斯科茨代尔市梅奥诊所血管和介入放射科。
^三英国皇家心脏基金会中心，伦敦国王学院，125 Coldharbour Lane，London SE5 9NU，UK St George’s Hospital，NHS Trust，Londom，UK。
⁴美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院血管外科。
⁵英国伦敦NHS信托圣乔治医院。
⁶英国利兹大学心血管和代谢医学研究所。
⁷美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所血管和介入放射科。
⁸英国SE5 9NU伦敦Coldharbour巷125号伦敦国王学院国王英国心脏基金会中心manuel.mayr@kcl.ac.uk。

PMID： 27068509
预防性维修识别码：项目经理4872879
内政部： 10.1093/cvr/cvw075

摘要

目的：细胞外基质重塑与许多血管疾病有关，包括静脉高压和静脉曲张。然而，迄今为止，还没有对人体静脉基质重塑进行系统分析。

方法和结果：为了了解静脉高压的后果，使用针对细胞外基质的蛋白质组学方法评估正常和静脉曲张。收集静脉切除术中切除的静脉曲张大隐静脉和冠状动脉搭桥术中获得的正常大隐静脉进行蛋白质组学分析。从静脉组织中富集细胞外基质蛋白。蛋白质组学分析显示存在超过150种细胞外基质蛋白，其中48种以前在静脉组织中未检测到。静脉曲张中细胞外基质重塑的特征是聚集蛋白聚糖和一些富含亮氨酸的小蛋白聚糖的丢失，I型胶原和层粘连蛋白的代偿性增加。对相同组织的基因表达分析表明，与静脉高压相关的重塑过程主要发生在蛋白质水平，而不是转录水平。静脉曲张中聚集蛋白聚糖的丢失与聚集酶表达的减少平行。乳糜酶和类胰蛋白酶β1是上调的蛋白酶。通过用重组酶培养正常大隐静脉，进一步探讨了这些丝氨酸蛋白酶对静脉细胞外基质的影响。蛋白质组学分析显示，用类胰蛋白酶β1消化后，细胞外基质大量降解。相比之下，糜蛋白酶的作用较弱，主要降解基底膜相关蛋白。

结论：目前的蛋白质组学研究对静脉曲张中血管细胞外基质的结构和调节成分的表达和降解提供了前所未有的见解。

关键词：细胞外基质；蛋白酶；平滑肌；静脉。

©作者2016。牛津大学出版社代表欧洲心脏病学会出版。

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图1
人类VSV的特征和两种不同蛋白质组学方法的结果。(A类)NSV和VSV用苏木精和伊红、Masson三色和α-平滑肌肌动蛋白（SMA）抗体染色。(B类)NSV的ECM蛋白(n个=6）和VSV(n个=6）使用我们之前发布的提取程序获得，并在通过凝胶-LC-MS/MS或溶液消化分离后通过LC-MS/MS进行分析。(C类)通过凝胶和溶液LC-MS/MS比较NSV和VSV中的差异蛋白表达。

图2
蛋白质组学揭示了NSV和VSV中不同的ECM组成。基于归一化蛋白质丰度的NSV和VSV中NaCl和GuHCl提取物的热图，以表示不同丰度的蛋白质(n个=每组6人）。划线蛋白通过MRM或western blot分析进行验证。用RT-qPCR在转录水平上分析粗体蛋白。未检测到其中一组的蛋白质用星号（*）标记。有关详细信息，请参阅表1.统计显著性(*P（P）*<0.05）使用Student’st吨-测试。

图3
VSV胶原蛋白组成的改变。(A类)NSV GuHCl提取物中纤维形成胶原蛋白的丰度与其他胶原蛋白家族的比较(n个=6）和VSV(n个=6）。出于可视化目的，在左侧面板中将CO5A1和CO5A2的总离子电流（TIC）放大10倍。CO6A1和CO6A3在右侧面板中缩小了五倍。(B类)不同的链在血管组织中形成交联胶原蛋白聚合物。蛋白质丰度散点图（以TIC表示）表明同一胶原蛋白的不同链具有高度相关性。(C类)与VSV相比，NSV胶原蛋白中羟基脯氨酸的比例。与其他家族相比，纤维形成胶原蛋白的比例要高得多。VSV中胶原蛋白含量的失调不影响胶原蛋白羟基化的速率。使用Student’st吨-测试。*表示*P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001.

图4
靶向蛋白质组学（MRM分析）验证蛋白质组学发现。(A类)MRM分析用于验证NSV中额外ECM蛋白的差异表达(n个=6）和VSV(n个= 6). 层粘连蛋白亚基β2；层粘连蛋白亚基γ1；PGS2，花色；ASPN，阿司匹林；TINAL、肾小管间质性肾炎抗原样蛋白；DERM，皮肤桥蛋白；VTNC，卵黄凝集素；PGCA，聚集聚糖；CO1A1和CO1A2、胶原α1（I）和α2（I）链。(B类)同一蛋白质的两个肽的MRM分析显示出高度相关性，这表明我们的测量结果具有稳健性。只有聚集蛋白聚糖（PGCA）相关性较差。使用Student’st吨-测试。*表示*P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001.

图5
ECM中蛋白质丰度与相应基因表达水平之间的差异。(A类)ECM靶点的相对基因表达(图2)在NSV和VSV中。NSV和VSV的蛋白质组学分析后检测到的蛋白质丰度水平显示用于比较（左图）。为了比较具有不同基础值的转录物和蛋白质，NSV的蛋白质丰度和基因表达水平设置为“1”。水平线表示NSV和VSV的SEM(n个=每组6人）。黑色方块代表重要(*P（P）*<0.05）学生决定的变化t吨-测试。(B类)mimecan（MIME）、fibronectin（FINC）、TGFβ诱导蛋白ig-h3（BGH3）、gelsolin（GELS）和decorin（PGS2）的免疫印迹。(C类)来自6名供体患者的静脉人SMC与TGFβ-1和TNFα孵育后，mimecan表达降低。用Ang II孵育不影响模拟物的表达。未模拟控制单元的表达级别由虚线表示。使用带有Dunnett校正的ANOVA检验计算统计显著性。***表示*P（P）*< 0.001.

图6
蛋白酶活性是VSV ECM重塑的促因。(A类)NSV中不同血管蛋白酶的Ct值(n个=6）和静脉SMC(n个=6）通过RT–qPCR测定。Ct值>35被认为是不可检测的。ADAMTS，一种具有血小板反应蛋白结构域的去整合素金属蛋白酶；丝氨酸蛋白酶HTRA1；基质金属蛋白酶、基质金属蛋白酶组织抑制剂；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。(B类)在VSV中观察到聚集酶ADAMTS1和ADAMTS4下调。数据点为平均值±SEM。黑色方块代表显著性(*P（P）*<0.05）学生决定的变化t吨-测试。(C类)糜蛋白酶和类胰蛋白酶β1在NSV和VSV中的分布。注意乳糜酶的广泛细胞染色。类胰蛋白酶β1呈斑块状、不太明显的分布。(天)糜蛋白酶（CMA1）和类胰蛋白酶β1（TRYB）在静脉组织中表达，但在培养的静脉SMC中未检测到。NSV和VSV的Western blot分析证实VSV中糜蛋白酶和类胰蛋白酶β1的丰度较高。这与CD68检测的增加和α-SMA的减少相平行。(电子)NSV样本(n个=5）在western blot分析之前，将其分成两半，并仅与两种蛋白酶或相应的缓冲液孵育。给出了两个实验的示例。用蛋白酶孵育可检测到tenascin C（TNC）的降解模式。方框中的数字表示全长蛋白质的预期大小（kDa）。在VSV中观察到tenascin的蛋白质降解产物，与相邻小组的观察结果类似。Ponceau S染色用作负荷对照。

图7
蛋白质组学研究结果总结。ECM改造是VSV形成的标志。本研究中检测到的差异反映了蛋白质丰度、基因表达和蛋白水解活性的变化。

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1. Hamdan A.静脉曲张和静脉功能不全的管理。JAMA 2012；308:2612–2621.-公共医学
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