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.2015年12月7日；211(5):1057-75.
doi:10.1083/jcb.201404147。

角蛋白支架调节表皮屏障形成、线粒体脂质组成和活性

当地警官库玛尔 1, Jamal-Edine Bouameur公司 1, 贾尼娜·巴赫 1, 罗伯特·赖斯 2, Hue-Tran Hornig-Do公司 三, 丹尼斯·鲁普 4, 妮可·施瓦兹 5, 苏珊·布罗德斯 6, 索伦·蒂林 1, 鲁道夫·E·鲁贝 5, 鲁道夫·魏斯纳 6, 普雷西·维贾亚拉吉, 克里斯蒂娜·布拉泽尔 1, 桑德拉·海勒 7, 汉斯·宾德尔 8, 亨利·洛夫勒·沃思 8, 塞贝尔 7, 托马斯·马金 9
附属公司

角蛋白支架调节表皮屏障形成、线粒体脂质组成和活性

当地警官库玛尔等。 J细胞生物学. .

勘误表in

  • 更正：角蛋白支架调节表皮屏障形成、线粒体脂质组成和活性。
    Kumar V、Bouameur JE、Bär J、Rice RH、Hornig-Do HT、Roop DR、Schwarz N、Brodesser S、Thiering S、Leube RE、Wiesner RJ、Vijayaraj P、Brazel CB、Heller S、Binder H、Löffler-Wirth H、Seibel P、Magin TM。 Kumar V等人。 细胞生物学杂志。2016年3月28日；212(7):877. doi:10.1083/jcb.20140414703042016c。Epub 2016年3月21日。 细胞生物学杂志。2016 PMID：27002167 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

摘要

角蛋白中间丝（KIFs）保护表皮免受机械力的影响，支持强大的粘附，帮助屏障形成，并调节生长。I型和II型角蛋白促进这些功能的机制尚不完全清楚。在这里，我们报道了缺乏所有I型或II型角蛋白的小鼠表现出严重的屏障缺陷和脆弱的皮肤，导致围产期死亡率和完全外显率。产前KtyI（-/-）和KtyII（-/--）（K8）小鼠角化膜（CE）的比较蛋白质组学表明，缺少KIF会导致许多CE成分的失调，包括桥粒蛋白1的下调。尽管loricrin的持续表达和许多Nrf2靶点的上调，包括CE成分Sprr2d和Sprr2h，但广泛的屏障缺陷仍然存在，这表明角蛋白是重要的CE支架。此外，我们发现KIF以细胞内方式控制线粒体脂质的组成和活性。因此，我们的研究通过将角蛋白支架与线粒体、粘附和CE形成联系起来，解释了伴有屏障障碍的角蛋白病的复杂性。

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数字

图1。
图1。
在KtyI出生前，K8/K18丝维持肠简单上皮的正常发育−/−老鼠。（A） KtyI胚胎肠中Krt8、Krt18和Krt19的免疫荧光分析+/+和KtyI−/−E18.5胚胎。棒材，20µm。（B） 肌动蛋白（指骨样蛋白）、E-cadherin（E-Cad）和结蛋白（DSP）的免疫荧光在E18.5 KtyI中的定位没有改变+/+和KtyI−/−胚胎。棒材，20µm。（C） Krt8、Krt18、Krt19和α-微管蛋白的蛋白质印迹作为KtyI肠道的负荷控制+/+和KtyI−/−E18.5胚胎。（D） E18.5 KtyI肠内未经改变的增殖率+/+和KtyI−/−基于Ki-67标记的胚胎。与相关图S2 DE18.5 KtyI肠的苏木精/伊红和周期性酸-希夫（PAS）染色切片+/+和KtyI−/−形态正常的胚胎。（F） 单纯上皮角蛋白在WTs和KtyI不同器官中的表达−/−和KtyII−/−K8公司E18.5胚胎。
图2。
图2。
KtyI和KtyII消融导致表皮增厚、过度增殖、细胞溶解以及颗粒层和层的明显结构异常。（A） E15.5和E18.5小鼠胚胎的苏木精/伊红染色皮肤切片。在E15.5处可见正常表皮，但在KtyI处可见过度增粘和细胞溶解（星号）−/−和KtyII−/−K8公司在E18.5处。KtyI中的大透明角质颗粒−/−以及他们在KtyII的缺席−/−K8公司表皮，显示出致密的角质层。棒材，20µm。（另请参阅中其他图片的不同放大倍数图S3 A). （B） 测量显示KtyI在E18.5处表皮厚度显著增加−/−和KtyII−/−K8公司（C）基于Ki-67的WT和KtyI表皮基底（B）和基底上（Sb）细胞增殖率定量−/−和KtyII−/−K8公司E18.5的胚胎（见图S3 C中的图片），显示在缺乏KIF的情况下显著增加。***，P≤0.001。
图3。
图3。
同种特异性角蛋白在KtyI中的表达和定位−/−和KtyII−/−K8公司表皮。（A） WTs和KtyI角蛋白定位的免疫荧光分析−/−和KtyII−/−K8公司E18.5处的表皮。注意两个KO中都没有KIF，KtyI中Krt1和Krt5的基底上聚集体−/−KtyII中Krt14广泛聚集，但Krt10不聚集−/−K8公司.基底膜用白色虚线表示。棒材，20µm。（B） Western blot分析Krt1、Krt5、Krt6、Krt10、Krt14和α-微管蛋白作为E18.5时WT和角蛋白缺乏胚胎皮肤提取物中的负荷控制。注意与A呈正相关，显示KtyI中Krt6显著增加−/−但Krt14在KtyII中的存在没有改变−/−K8公司与KtyII相比+/+K8公司.
图4。
图4。
KtyI皮肤的电镜分析+/+和KtyI−/−E18.5描述结构变化的胚胎。（A和B）基岩地层的半桥粒（黑色箭头）在KtyI中很容易检测到−/−动物。然而，值得注意的是，KtyI基底细胞层缺乏角蛋白丝（KF）和发生细胞溶解−/−表皮（B，星号）。插图显示半桥粒和相邻的基底层（BL）放大率较高。KtyI基底上层的（E和F）桥粒（黑色箭头）−/−与KtyI相比，表皮较小且较少出现+/+注意KtyI棘层中的宽细胞间隙−/−表皮和线粒体内内含物（白色箭头）。E和F的插图显示桥粒的放大率较高。（G和H）角质层中的角质体（白色箭头）在KtyI中很容易区分−/−动物。插图显示角质桥粒放大率较高。棒材：（插入）100 nm；（A、B和E–H）1µm；（C和D）5µm。
图5。
图5。
KtyI的不同表皮屏障缺陷−/−和KtyII−/−K8公司小鼠胚胎。（A） 甲苯胺蓝分析显示KtyI中染料不耐屏障获得中度延迟−/−KtyII严重延迟−/−K8公司与WT胚胎相比。棒，5毫米。（B和C）来自E18.5胚胎的85%的CE在KtyI中被破坏−/−与KtyII的99%相比−/−K8CE与WT的比较。棒材，100µm。（D） E18.5表皮的免疫荧光分析显示，KtyI中的总苞素、loricrin和丝聚蛋白的分布高度相似+/+和KtyI−/−注意KtyI中纤维蛋白染色减少−/−样品。基底膜用白色虚线表示。棒材，20µm。（E） E18.5胚胎皮肤提取物的Western blotting显示KtyII中的总苞蛋白（Ivl）减少，loricrin（Lor）和filggrin（Flg）缺失−/−K8公司同时KtyI中profilaggrin（Pro-flg，上部带）转化为filagglin（底部带）的过程减少−/−皮肤；α-微管蛋白（tub）作为负荷控制。（F） 转录组分析揭示KtyI屏障蛋白编码基因表达的显著变化−/−和KtyII−/−注意到KtyII中一些屏障蛋白编码基因的强烈下调−/−K8公司仅（红色）；n个= 3. （G） 定量RT-PCR分析证实KtyII中loricrin、filagrin和hornerin基因转录缺失−/−K8公司KtyI中总苞素和洛里克林mRNA的上调−/−皮肤。***，P≤0.001。
图6。
图6。
KtyI中Nrf2的诱导−/−和KtyII−/−K8公司产前表皮。（A） E18.5 KtyI转录组图谱中所选Nrf2靶基因的强上调−/−和KtyII−/−K8公司皮肤RNA。（B）使用定量RT-PCR分析对A中的数据进行确认。（C） 转录组图谱和定量RT-PCR显示角蛋白缺乏胚胎皮肤中Nrf2 mRNA增加。（D） 建立KtyI中Nrf2蛋白强烈增加的蛋白质印迹−/−和KtyII−/−K8公司E17.5和E18.5，但Keap1无差异。（E） 根据E16.5–E18.5胚胎的免疫组织化学，Nrf2在两个KO小鼠表皮中持续上调和核定位。棒材：（主要）50µm；（插图）10µm.*，P≤0.05。
图7。
图7。
角蛋白是E18.5的主要CE成分。WTs和KtyI富集CE制剂的蛋白质组分析−/−和KtyII−/−K8公司小鼠胚胎和随后的质谱分析。（A） 介绍了小鼠皮肤主要CE角蛋白的光谱计数。I型角蛋白用红色下划线，II型角蛋白则用绿色下划线。除Krt1和Krt10外，Krt77、Krt75和Krt78代表主要CE成分。（B） 与A中相同，但KtyI中的II型角蛋白+/+和KtyI−/−老鼠。注意KtyI中除Krt6外，II型角蛋白显著减少−/−交联样品。（C） 值得注意的是，KtyII中只有I型角蛋白Krt10显著降低−/−K8公司而Krt14和Krt17保持不变，KtyII中有更多Krt16交联−/−K8公司.*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001。
图8。
图8。
CE蛋白质组图谱依赖于角蛋白。根据是否存在I型和II型角蛋白的功能对CE成分进行分组。（A） CE启动和加固。KtyI中桥粒蛋白-1减少（蓝色下划线），但角膜基质和CE起始和增强蛋白增加−/−和KtyII−/−K8与WT相比，KtyI中交联的谷氨酰胺转胺酶（tgm-1和-3）和花生四烯酸12-脂氧合酶（alox12b）较少−/−和KtyII−/−K8公司与WT相比。（B）除repetin外，两株KO菌株中的主要CE结构蛋白与WT相比较交联较少。（C）参与末端分化和屏障功能的蛋白酶和蛋白酶抑制剂的交联在KtyI中也发生了类似的变化−/−和KtyII−/−K8公司与WT相比。组织蛋白酶-D（Ctsd）和Spink5用橙色下划线，仅在KtyII中改变−/−K8公司（D）增强KtyI中报警蛋白的交联−/−和KtyII−/−K8公司与WT相比（红色哈希标记hspa2，在KtyII中上调−/−K8公司仅限）.*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001。
图9。
图9。
线粒体组成和活性的细胞内和角蛋白依赖性变化。（A） KtyI表皮线粒体不规则分布，胞质点状定位（红箭头）−/−E18.5胚胎。在WT对照组中，线粒体在棘层（红色星号）的细胞核周围以弥漫模式富集，并与颗粒层中的细胞边界对齐。基底膜用白色虚线表示。棒材，10µm。（B） 线粒体呼吸链亚单位和β-肌动蛋白的Western blotting作为KtyI提取物的负荷控制+/+、KtyI−/−和KtyI−/−K17号公路角质形成细胞。（C） B的量化，归一化为负载控制。注意，在没有角蛋白的情况下，NdufA9、NdufV2（复合物I）和Cox1（复合体IV）的特异性增加，但CORE2（复合物III）、SDHA（复合物II）和α-亚基（复合物V）的特异增加没有。（D） 纯化线粒体的定量脂质分析显示KtyI中PE和CL水平升高，PC和PS降低−/−与KtyI相比+/+和KtyI−/−K14号公路拯救角质形成细胞。（E） KtyI的耗氧量增加−/−与KtyI相比+/+和KtyI−/−K14号公路角质形成细胞。（F） 细胞ATP水平在KtyI中增加−/−与KtyI相比+/+和Krt14重新表达细胞。*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001。
图10。
图10。
主要调查结果摘要。（A） 角蛋白缺乏小鼠的主要表型比较（Reichelt等人，2001年、2004年；Reichelt-和Magin，2002年；Kröger等人，2011年；Roth等人，2012年B；Bär等人，2014年）。（B） 将角蛋白丝整合为对CE形成和线粒体组成/活性至关重要的支架的模型。
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