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.2015年12月11日；290(50):30193-203.
doi:10.1074/jbc。M115.662221。 Epub 2015年10月20日。

人类端粒酶逆转录酶（hTERT）转录需要Sp1/Sp3与启动子结合和允许的染色质环境

德成 1, 赵元君 2, 王树文 1, 贾文文 三, 九红康 三, 朱继岳 4
附属公司

人类端粒酶逆转录酶（hTERT）转录需要Sp1/Sp3结合启动子和允许的染色质环境

德成等。 生物化学杂志. .

摘要

人类端粒酶基因hTERT的转录受转录因子（TF）及其染色质环境的调节，转录因子包括Sp1家族蛋白。为了了解其在相关染色质背景下的调控，我们使用了含有hTERT基因的160 kb人类基因组序列的细菌人工染色体报告器。在染色体整合后，细菌人工染色体重演了内源性hTERT表达，而非瞬时报告。Sp1/Sp3的表达与hTERT启动子活性无关，这些TF在端粒酶阳性细胞和端粒酶阴性细胞中都与hTER启动子结合。近端GC-box的突变导致hTERT启动子活性显著降低，所有五个GC-boxe的突变都消除了其转录活性。GC-boxes突变和内源性Sp1的敲除均不影响其他TF（包括E-box-binding蛋白）与启动子的结合，也不影响端粒酶阳性和阴性细胞中hTERT启动子处组蛋白H3K9的组蛋白乙酰化和三甲基化。结果表明，启动子与Sp1/Sp3的结合是hTERT转录的关键步骤，但不是限制步骤。hTERT转录需要一个允许的染色质环境。重要的是，我们的数据还揭示了GC-box和E-box在hTERT调节中的不同功能；尽管GC-boxes对启动子活性至关重要，但与E-boxes结合的因子起到了去表达hTERT启动子的作用。

关键词：细菌人工染色体；染色质免疫沉淀；染色质调节；染色质依赖性基因调控；基因阻遏；基因沉默；基因转录；特异性蛋白1（Sp1）；端粒酶逆转录酶；转录。

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数字

图1。
图1。
关于小时基因和Sp1表达。 A类，的hTERT基因基因和启动子突变。这个顶部是一个160kb的人类基因组区域，包含小时,CRR9级、和Xtrp2号机组基因座。外显子被指定为垂直钢筋和线。水平线的黑色部分表示重复序列。水平箭头指示转录方向。hTERT起始密码子上游的295-bp核心启动子如下部BAC和含有突变的质粒构建物列在正确的。B类成纤维细胞中hTERT mRNA的表达。mRNA水平通过qRT-PCR分析测定，并归一化为18S核糖体RNA。正常人成纤维细胞(NHF公司)GM847和3C166a是端粒酶阴性细胞，而GM639和3C167b是端粒蛋白酶阳性细胞。误差线表示平均值±S.E。C类、Sp1和Sp3 TFs的表达。蛋白质表达通过Western分析确定，使用的抗体如左边.
图2。
图2。
瞬时转染hTERT启动子报告子的调控。 A类，瞬时转染hTERT启动子的活性。质粒报告员被转染到Tel+（3C167b）和电话负极（GM847）细胞。误差线表示平均值±S.E。B类，Sp1蛋白过度表达。电话+和电话负极仅用pLXSN-Sp1或pLXSN载体转染细胞，2天后收获用于Western分析。C类，Sp1过表达对瞬时hTERT质粒报告子的调节。hTERT报告子与pLXSN-Sp1或pLXSN载体共转染到Tel中+(上部面板)和电话负极(下部面板)单元格。误差线表示平均值±S.E。D类，shRNAs对Sp1的瞬时报告子pBT-255的调节。pBT-255和pLKO质粒包含shSp1a、spSp1b或扰乱序列(可控硅)共转染到Tel中+细胞。在所有瞬态报告分析中，在转染后48小时测量萤火虫荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚共转染质粒pRL-SV40的荧光素酶活性。误差线表示平均值±S.E。
图3。
图3。
瞬时BAC报告基因H（wt）中hTERT启动子的活性。 A类，在成纤维细胞系中瞬时转染BAC H（wt）。将H（wt）转染细胞，48小时后测定荧光素酶活性。hTERT启动子活性以雷尼利亚荧光素酶(荧光素酶)从hTERT启动子到萤火虫荧光素酶(流感病毒)来自CRR9发起人。误差线表示平均值±S.E。B类，Sp1瞬时转染H（wt）中hTERT启动子的调节。电话+（3C167b）和电话负极（GM847）细胞仅与H（wt）和pLXSN-Sp1或pLXSN载体联合转染。转染48小时后进行荧光素酶检测。误差线表示平均值±S.E。C类，H（wt）中GC-box突变的影响。H（wt）和突变BAC被转染到Tel+和电话负极2天后测定细胞和荧光素酶活性。误差线表示平均值±S.E。D类Sp1激活瞬时BAC报告中野生型和突变型hTERT启动子。用pLXSN-Sp1或pLXSN载体共同转染BACs，48小时后测定荧光素酶活性。误差线表示平均值±S.E。
图4。
图4。
染色报告人H（wt）。 A类，RMBT战略的示意图。Lox511和loxP表示为黑色和灰色三角形分别是。受体基因座被鸡β-球蛋白绝缘体cHS4包围(Ins公司在中八角形)在每一侧。B类电话中的染色体BAC报告者H（wt）的hTERT启动子活性+和电话负极线。在未经TSA（−TSA（交通安全管理局）)或250 n米TSA（交通安全管理局）(+TSA（交通安全管理局）)持续24小时。hTERT启动子活性如下所示荧光素酶/流感。误差线表示平均值±S.E。C类转基因和内源性hTERT启动子的TF结合和组蛋白修饰。来自Tel的染色质片段+/H（wt）和电话负极/使用抗TFs和H3K4me3抗体沉淀H（wt）细胞，然后进行qPCR分析。图中所示为沉淀片段，作为输入染色质的百分比。用于ChIP分析的PCR扩增子位置如下所示。1，hTERT启动子上游5k或5-kb；2内源性启动子；三，转基因启动子；4、RlucO或Rluc ORF。灰色矩形代表hTERT基因的外显子1和2。TSS公司，转录起始位点。误差线表示平均值±S.E。D类，通过Sp1。电话+/H（wt）和电话负极/用pLXSN-Sp1或pLXSN载体转染H（wt）细胞，2天后测定荧光素酶活性。嘲弄，模拟转染。误差线表示平均值±S.E。
图5。
图5。
GC-box突变对染色体hTERT启动子的影响。 A类野生型和突变型hTERT启动子的活性。电话+和电话负极含有完整的H（wt）、H（gc）、H（gc5）和H（EboxD）的细胞在没有TSA（−TSA（交通安全管理局）,上部图表)或250 n米TSA（交通安全管理局）(+TSA（交通安全管理局）,下部图表)收获前24小时。误差线表示平均值±S.E。B类和C类，TF绑定(B类)和组蛋白修饰(C类)野生型和突变型BAC中的hTERT启动子。来自Tel的染色质片段+使用抗TF抗体沉淀含有BAC报告子的细胞(B类)或特定组蛋白修饰(C类)然后进行qPCR分析。图中所示为沉淀片段，作为输入染色质的百分比。H3Ac公司和H4Ac公司分别指乙酰化组蛋白H3和H4。H3K4me2型和H3K4me3型是二甲基和三甲基H3K4。误差线表示平均值±S.E。
图6。
图6。
Sp1家族蛋白KD对Tel中hTERT调节的影响+细胞。 A类，通过shRNA检测Sp1和Sp3蛋白的KD。电话+用针对Sp1或Sp3的慢病毒shRNA感染细胞4天。蛋白质表达通过Western分析确定，使用所示抗体。B类，Sp1/Sp3 KD对内源性hTERT表达的影响。电话+用慢病毒shRNAs感染细胞，用1μg/ml嘌呤霉素筛选细胞4天。通过qRT-PCR测定hTERT mRNA水平，并将其归一化为18S rRNA。误差线表示平均值±S.E。C类，Sp1/Sp3 KD对染色质化hTERT启动子的影响。电话+/用慢病毒shRNA感染H（wt）细胞，并在感染后3天和4天测量荧光素酶活性。hTERT启动子活性测定如下荧光素酶/流感。Vec公司慢病毒载体pLKO.1；可控硅，打乱了shRNA。误差线表示平均值±S.E。
图7。
图7。
Sp1 KD对染色质结构的影响。 A类和B类，TF绑定(A类)和组蛋白修饰(B类)内源性和转基因hTERT启动子。电话+/H（wt）细胞感染慢病毒，并在感染后4天采集用于ChIP分析。误差线表示平均值±S.E。
图8。
图8。
hTERT转录模型。基因组DNA表示为水平线和hTERT外显子如图所示灰色矩形核小体描述为圈子。顶部，hTERT启动子在电话中被抑制负极细胞。尽管启动子受Sp1家族TF的约束，但其他TF无法访问它。中部，的虚线箭头表明hTERT启动子上的结合位点在允许的染色质环境中可被TF接近。底部，在电话中+细胞，E-box-binding蛋白和其他TF的结合导致转录起始位点下游的+1核小体进一步重塑，这表明虚线椭圆。转录由水平箭头在活性启动子上。
图9。
图9。
TSA治疗对潜在转录调控因子的影响。 A类，通过TSA治疗调节mRNA水平。电话+（3C167b）和电话负极（GM847）细胞未经TSA处理或用0.2μ米收集24小时TSA总RNA并通过定量RT-PCR进行分析。数据归一化为18S rRNA。误差线表示平均值±S.E。B类TSA治疗对c-Myc蛋白水平的影响。电话+和电话负极用0.5μ米通过Western分析测定24h的TSA蛋白表达。
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