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比较研究
.2015年10月15日6:8549。
doi:10.1038/ncomms9549。

RFX转录因子对小鼠听力至关重要

兰·埃尔科恩 1, 比阿特丽斯·米隆 2, 劳拉·莫里森 2, 马南·沙阿 2, 萨拉斯·维贾亚库玛 三, 马诺伊·拉切拉 2, 卡门·C·莱奇 4, 洛娜·西里皮诺 2, 沙丹·哈迪 5, 米歇尔·魏斯盖特 6, 艾玛努埃尔·巴拉斯 7, 克里斯托夫·德·施密德 8, 奥尤特夫·艾特·路易斯 7, 阿什利·巴恩斯 2, 杨松 9, 大卫·J·艾森曼 2, 埃夫拉特·埃利亚胡 10, 格雷戈里·弗罗伦科夫 5, 斯科特·斯特罗姆 2, 贝内迪克特·杜兰德 6, 诺兰·扎格鲁尔 4, 谢里·琼斯 三, 沃尔特·赖斯 7, 罗娜·赫扎诺 2 9 11
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比较研究

RFX转录因子对小鼠听力至关重要

兰·埃尔科恩等。 国家公社. .

摘要

感音神经性听力损失是一种常见且目前不可逆的疾病，因为哺乳动物的毛细胞（HC）无法再生，而当前的干细胞和基因传递协议只能产生不成熟的HC样细胞。重要的是，尽管已经描述了胚胎HC发育的转录调节器，但对成熟HC的出生后调节器知之甚少。在这里，我们将细胞类型特异性功能基因组分析应用于出生后早期小鼠听觉和前庭感觉上皮的转录体。我们确定RFX转录因子是HC特异转录体的基本和进化上保守的调节因子，并在发育中的HC中检测到Rfx1、2、3、5和7。为了了解RFX在听力中的作用，我们制作了Rfx1/3条件敲除小鼠。我们的研究表明，这些小鼠由于最初发育良好的外HC的快速丢失而失聪。这些数据确定了RFX在终末期分化外HC听力和生存中的重要作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

Scott Strome是生物技术公司Gliknik Inc.的联合创始人和主要股东。他还获得了与B7-H1（PD-L1）相关的知识产权版税，该专利由梅奥医学院授权给第三方。其余的作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1。HC转录组分析。
(一)来自内耳的代表性图像阿托h1/nGFP鼠标。听觉和前庭系统中的所有HC均为GFP（+）。共同耳蜗；Cr-crista；S-球囊；U胞囊。比例尺，50μm。(b条)耳蜗和前庭感觉上皮的示意图，说明每个器官中指定为HC、ENHC和NEC的细胞。(c（c）)新生儿耳蜗上皮流式细胞术的代表性图像Atoh1/nGFP老鼠。左上象限-pre排序图：HCs为双阳性（DP），ENHCs为CD326（SP）阳性，NECs为CD32和GFP（DN）阴性。对分选细胞的分类后分析表明，HC的细胞类型特异性纯度>94%，NEC的纯度>99%，ENHC的纯度>98%。(d日)基于数据集中所有表达基因的层次聚类，根据细胞类型将探测样本分为三个主要分支：HC、NEC和ENHC（c-耳蜗和v-前庭样本）。(e（电子）)两个主要簇包含HCs中表达升高的基因。每个簇由其基因表达水平的平均模式表示（误差条：±s.d.，计算分配给每个簇的所有基因）。在聚类之前，对每个基因的表达水平进行标准化（平均值=0，标准差=1）。这种方法能够对具有相似模式但不一定具有相同表达量的基因进行分组。整个簇集如补充图2所示。(如果)丰富的GO类别P（P）多次测试错误发现率修正后，值<0.01（超几何检验）。(克)表达微阵列数据集（左）中检测到的耳蜗HCs（上）和前庭HCs（下）的特异标记基因，并经RNA-seq数据集（右）确认。红色代表浓缩，绿色代表耗尽。数据表示三个生物复制的结果。
图2
图2。RFX结合特征在HC富集基因的启动子中富集。
(一)德诺沃模体分析表明，内耳HCs中表达升高的基因的启动子显著富集了与TFs RFX家族结合特征相匹配的DNA模体（已知RFX模体来自TRANSFAC DB；登录号M00281）。在225个HC相关基因的启动子中检测到富集基序（富集因子=2.7；P（P）值=1.5E−37）。(b条)225个假定RFX HC靶基因中过度表达的GO功能类别。(c（c）)在纤毛发生中起作用的选定假定RFX靶点的表达模式(n个=3; 误差线：±s.d.）。(d日)HC富集被定义为每个基因在HCs中的表达与其在三种探测细胞类型（HC、ENHC和NEC）中的平均表达之间的比率。该图比较了这些HC富集措施的累积分布（以log2标度；x个-轴）。RFX1靶点的分布显著右移，表明其作为一个群体在HCs中的表达水平显著升高(P（P）值=1.3E−77；Wilcoxon试验）。应用于RFX3的ChIP-Seq靶标的类似分析见图9b。
图3
图3。在斑马鱼HCs中，RFX靶基因的表达升高。
(一)5 dpf的图像ppv3b:GFP在内耳HCs（黄色箭头）和神经肥大HCs（白色箭头）中显示GFP表达的幼虫。(b条)斑马鱼显示神经肥大HC的示意图。(c（c）)游离5dpf流式细胞术的代表性图像ppv3b型：GFP幼虫。Top-dot图分析揭示了GFP（+）细胞的独特群体（右）。分类后分析显示GFP（+）细胞的细胞类型特异性纯度>92%（中间面板），阴性细胞的纯度>99%（底部）。(d日)已知小鼠HC富集基因斑马鱼同源基因的表达。斑马鱼GFP（+）细胞群中的表达丰富，而NEC标记物（例如，Zeb1号机组)，血管上皮细胞（VE；例如，氯化物5)和神经细胞（N；例如，第5a3列)减少（基于RNA-seq的结果）。(e（电子）)斑马鱼HC（GFP（+）细胞中，我们在小鼠HCs中确定的225个RFX假定靶点的斑马鱼同源基因的表达显著升高。计算斑马鱼数据集中每个基因的GFP（+）和GFP（−）细胞表达水平之间的比率。该图比较了这些比率的分布（以对数2为单位；年-轴）在RFX目标（左箱线图）的一组同源基因和数据集中的所有其他基因（右箱线）之间。方框表示第一和第三个四分位数；方框内的水平带表示中间值。晶须延伸到最极端的数据点，该数据点距离方框的四分位范围不超过1.5倍。P（P）使用Wilcoxon检验计算的值。(如果)与面板类似(e（电子）)，但使用独立的斑马鱼基因表达数据集。在这里，与非HCs中的表达水平相比，HCs中RFX靶基因的表达显著升高。
图4
图4。RFX3在小鼠内耳中的表达。
用MYO6抗体染色的P1野生型小鼠的内耳切片，其以红色标记内耳毛细胞（左图）和RFX3（右图），并以蓝色用DAPI复染。在所有HCs中检测到RFX3的稳健核表达，而在ENHCs中则检测到较弱的表达。RFX3抗体对立体纤毛的染色是非特异性的，通过对cKO耳进行染色来验证，其中核染色被消除，立体纤毛染色持续存在（补充图11）。内毛细胞；OHC，外毛细胞。代表性图片n个>5个实验。比例尺，60μm。
图5
图5。卢比基因是听觉所必需的。
(一)听力阈值升高卢比x1/3cKO小鼠：3个月大卢比x1cKO和3卢比cKO的听力阈值在8和16千赫时与野生型同卵双胞胎的听力阈值无明显区别。然而，卢比x1/3与出生后第22天的年龄匹配的对照组相比，cKO小鼠的听力阈值显著提高。他们的听力阈值发展为P90测得的严重听力损失。在P90时，所有菌株在32 kHz时均表现出较高的阈值。箭头表示平均阈值可能高于所示阈值，因为许多动物在测试的最大刺激水平下没有ABR。误差线为±s.e.m.“*”为P（P）值<0.01（P22数据的多变量方差分析和P90数据的方差分析）。(b条)畸变产物耳声发射（DPOAE）振幅也显著降低，表明外HC功能卢比x1/3cKO小鼠与野生型对照组的比较。在P22测试以下基因型：卢比x1/3cKO公司(n个=4），野生型(n个=10); 第90页：卢比x1cKO公司(n个=3),Rfx3型cKO公司(n个=8),Rfx1/3cKO公司(n个=10），野生型(n个=6).
图6
图6。终末分化OHC的快速变性卢比x1/3cKO小鼠。
(一)野生型（P12）和卢比x1/3cKO（P12和15）用卵磷脂染色（绿色），n个所有基因型=4。在P15 cKO小鼠中可以看到OHC的弥散性丢失，从基底向中间进行。(b条)P15小鼠IHC的侧视图，显示突变小鼠的IHC中保留的激肽菌。插图显示了保留的激肽菌的高倍图像。(c（c）)3个月大的小鼠中间弯的SEM显示，双cKO小鼠的OHC完全退化，IHC受损。N个所有基因型=4。比例尺一,c（c）：5微米；对于b条：0.5微米。(d日)Western blot分析检测P15野生型（对照组）、P12和P15分离的耳蜗导管中细胞死亡和存活标记物表达的变化卢比x1/3cKO小鼠（左侧面板）。进行密度测定分析，以量化相对于野生型组织中水平的蛋白质表达变化（右图）。结果显示caspase 3和BAX显著增加，BCL2减少，与细胞死亡一致。肌动蛋白被用作加载控制。左边距表示分子量。每条通道由四个耳朵的组织组成。这组实验使用生物独立样本进行了两次，并显示了一个具有代表性的图。
图7
图7。HCs的静纤毛束卢比x1/3cKO小鼠正确极化。
(一)来自3天大婴儿基底、中间和顶端的代表性共焦显微镜图像卢比x1/3cKO小鼠(n个=3）和它们的野生型配偶控制(n个=3). 耳蜗用phaloidin（绿色）染色以确定肌动蛋白细胞骨架和立体纤毛束，乙酰化微管蛋白抗体（红色）染色以确定kinocillium。野生型和突变型小鼠的静纤毛束在基底和中间转弯处出现适当的极化。在P3处的顶端转折处，野生型和突变型小鼠的束极性组织较少。比例尺，5μm。(b条)定量野生型和突变型小鼠束的偏离角，从垂直于柱细胞轴的线穿过HC的中间测量。底部和中间转弯的结果以散点图表示。每个点代表一个HC，水平条代表中间值。从每种基因型的三只不同小鼠的耳蜗和两个区域（基底部和中间部）分别测量五个连续的IHC、第一排OHC、第二排OHC和第三排OHC的极性。采用单因素方差分析和Tukey检验对结果进行比较。未检测到统计上的显著差异(P（P）值>0.05）。
图8
图8。卢比x1/3对于OHC的早期分化来说是不必要的。
(一)P8中间弯的SEM图像卢比x1/3cKO小鼠及其野生型对照组的耳蜗感觉上皮外观正常，有一排IHC和三排OHC。所有HC都有kinocilia。(b条)IHC和OHC的高倍横向视图卢比x1/3cKO和室友P8对照显示kinocilia正确形成。(c（c）)IHC的高倍中间视图；插图从虚线框中指示的区域以更高的放大率显示尖端链接。(d日)P8耳蜗导管的基底旋转卢比x1/3cKO和对照组用prestin（红色）和phalloidin（绿色）抗体染色。所有OHC在其侧壁表达prestin。(e（电子）)利用FM1-43染料的摄取进行功能分析，以确定是否存在完整的转导通道。野生型和双cKO小鼠耳蜗中的HCs在10秒内将染料内化一,d日,e（电子）：5微米；的比例尺b条,c（c）：0.5微米。n个对于P8 SEM分析，＝3，n个=4，用于prestin染色和n个=8，用于FM1-43分析。
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参考文献

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