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.2015年10月7日；10（10）：e0140025。
doi:10.1371/journal.pone.0140025。 2015年电子收集。

内质网应激诱导自噬提供细胞保护，防止化学性缺氧和氧化损伤，改善肾缺血再灌注损伤

Bhavya B Chandrika公司 1, 程阳 1, 杨欧 1, 冯小可 2, 贾马利·穆霍扎 1, 亚历山大·福尔摩斯 三, 苏·修斯 三, Sarika Deshmukh公司 1, 兰迪·沙恩 4, 古尔·P·考沙尔 5
附属公司

内质网应激诱导自噬提供细胞保护，防止化学性缺氧和氧化损伤，改善肾缺血再灌注损伤

Bhavya B Chandrika公司等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

我们研究了内质网（ER）应激诱导的自噬是否能在体外对氧化剂和化学缺氧导致的肾小管上皮细胞损伤以及体内缺血再灌注损伤提供细胞保护。我们证明，内质网应激诱导剂衣霉素触发未折叠蛋白反应，上调内质网伴侣Grp78，并激活培养中肾小管上皮细胞的自噬途径。抑制内质网应激诱导的自噬可加速caspase-3激活和细胞死亡，表明内质网胁迫诱导的自吞噬具有促生存作用。与野生型细胞相比，内质网应激下自噬缺陷的MEF增强了caspase-3激活和细胞死亡，这一发现进一步支持内质网胁迫诱导的自噬的细胞保护作用。内质网应激诱导自噬可显著保护细胞免受氧化剂H2O2和叔丁基过氧化氢以及抗霉素A诱导的化学缺氧。相反，抑制内质网胁迫诱导的自噬或自噬缺陷细胞可显著增加细胞死亡，以应对氧化剂损伤和化学缺氧。在小鼠肾脏中，与培养的肾上皮细胞类似，衣霉素触发内质网应激，显著上调Grp78，激活自噬，但不影响自噬流量。此外，内质网应激诱导的自噬可显著改善肾缺血再灌注损伤，这一点从肾功能和组织学的显著改善中可见一斑。氯喹抑制自噬可显著增加肾脏IR损伤。这些研究强调了内质网应激诱导的自噬在体内外肾脏缺血再灌注损伤中的有益影响。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。药理学内质网应激诱导剂衣霉素和他司加金可诱导内质网胁迫、UPR反应和自噬。
答：。如图所示，用1μg/ml衣霉素（TN）处理LLC-PK1细胞不同的时间长度。用Grp78和Chop特异性抗体进行western blot分析细胞裂解物（每条通道100μg蛋白质），以监测内质网应激反应的诱导。β-肌动蛋白作为负荷控制。B。如图所示，用1μg/ml衣霉素（TN）处理LLC-PK1细胞不同的时间，并对细胞裂解物进行IRE1、pPERK、PERK，peIF2α和eIF2α的免疫印迹。β-肌动蛋白作为负荷控制。C和D。如图所示，用（C）1μg/ml衣霉素（TN）或（D）100 nM thapsigargin（TG）处理LLC-PK1细胞不同时间，并通过western blot监测LC3-I到LC3-II的转化来分析自噬诱导。β-肌动蛋白作为负荷控制。条形图描述了通过密度测定法量化的LC3 II/LC3 I的比率*P（P）<与对照组未处理细胞（0h）相比，0.05**P（P）与对照组未处理细胞（0h）相比<0.01***P（P）与对照未处理细胞（0小时）相比<0.001。E.公司。在盖玻片上培养LLC-PK1细胞，并使用杆状病毒GFP-LC3载体进行瞬时转染16 h。按照指示，在不同的时间点使用1μg/ml衣霉素（TN）或100 nM thapsigargin（TG）进行治疗。每个时间点后固定细胞，并使用奥林巴斯荧光显微镜捕获图像。典型图像显示，随着治疗时间的推移，点状结构增加。
图2
图2。药物抑制剂抑制内质网应激诱导的自噬可触发LLC-PK1细胞中caspase–3/7活化和凋亡细胞死亡。
A、 B和C。内质网应激诱导剂衣霉素（TN）处理LLC-PK1细胞12小时后，再使用药物自噬抑制剂10 mM3-MA处理(A类)，200 nM沃特曼（麦芽）（B） ，或50μg/ml氯喹（CHL）(C类)用于指定的不同时间长度。细胞裂解物（25μg蛋白质）用于荧光光谱法胱天蛋白酶-3/7活性测定。对照组为未经处理的细胞。结果显示为三个独立实验的平均值±SEM*P（P）<与对照细胞或膜霉素处理细胞相比，0.05**P（P）与膜霉素处理的细胞相比，<0.01***P（P）与膜霉素处理的细胞相比<0.001。D。用内质网应激诱导剂衣霉素（TN）处理LLC-PK1细胞，不含自噬抑制剂，也不含自吞噬抑制剂。处理细胞裂解物（50μg蛋白质）进行western blots，以使用裂解的caspase-3特异性抗体检测活性caspase–3。β-actin作为负荷控制。E和F。用内质网应激诱导剂衣霉素（1μg/ml）处理LLC-PK1细胞12 h，然后用10 mM 3-MA处理(E类)或50μg/ml氯喹(F类)用于规定的不同时间长度。用碘化丙啶染色法通过FACS分析测定这些处理下凋亡细胞的百分比。结果表示为三个独立实验的平均值±SEM*P（P）<与对照细胞或膜霉素处理细胞相比，0.05**P（P）与膜霉素处理的细胞相比，<0.01***P（P）与膜霉素处理的细胞相比<0.001。
图3
图3。肾细胞中siRNA对Atg5和beclin–1的沉默和Atg5-KO MEF在衣霉素治疗后触发caspase激活。
答：。LLC-PK1细胞未经处理（Con）或转染附件5或贝克林-1如材料和方法一节所述，将siRNA或干扰siRNA持续24小时，并对细胞裂解物进行Atg5和beclin–1的免疫印迹。蛋白质水平通过密度测定法进行量化。siRNA介导的沉默被评估为beclin或Atg5与β-肌动蛋白相对于未处理（Con）细胞的比率设置为1。每条车道下方显示了每个处理的相对比率。B用1μg/ml衣霉素处理Atg5或beclin–1 siRNA沉默的LLC-PK1细胞12小时、16小时和24小时，并使用荧光底物进行caspase–3/7活性测定。结果表示为三个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）将显示的<0.001与加扰siRNA处理的细胞进行比较。C。用内质网应激诱导剂衣霉素（1μg/ml）处理野生型和Atg5-KO MEF 16小时、24小时和30小时。取细胞裂解物（25μg蛋白质）进行荧光分光光度法半胱天冬酶-3/7活性测定。控制是车辆处理的细胞。结果以三个独立实验的平均值±SEM表示*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）与WT衣霉素治疗的MEF相比，显示<0.001。D。用内质网应激诱导剂衣霉素（1μg/ml）处理野生型和Atg5-KO MEF 16小时、24小时和30小时。细胞裂解物（50μg蛋白质）用于使用活性caspase–3的特异抗体进行western blot。β-actin作为负荷对照。所示结果代表了三个独立的实验。E.公司。用内质网应激诱导剂衣霉素（1μg/ml）处理野生型和Atg5-KO MEF 24小时。在四个独立的实验中，用DAPI染色测量了细胞核碎片和浓缩以及细胞收缩，作为凋亡的形态学特征。凋亡的量化如图（右）所示*P（P）与WT衣霉素处理的MEF相比，显示<0.05。
图4
图4。Tunicamycin预处理可保护肾上皮细胞免受氧化损伤和化学缺氧，当使用自噬抑制剂时，这种保护作用被逆转。
答：。用1μg/ml衣霉素（TN）预处理LLC-PK1细胞12 h，然后用10 mM 3-MA（左）或50μg/ml氯喹（右）处理1 h，然后再用200μM h202不同的持续时间，如图所示。LDH释放试验作为细胞毒性指标。结果代表四个独立实验的平均值±SEM*P（P）与衣霉素+H相比<0.05202-处理过的细胞**P（P）与H相比<0.01202-处理过的细胞。B。LLC-PK1细胞用1μg/ml膜霉素（TN）预处理12小时，然后用10mM 3-MA（左）或50μg/ml氯喹（CHL）（右）处理1小时，然后用50μM TBHP处理不同的时间。LDH释放试验作为细胞毒性指标。结果代表四个独立实验的平均值±SEM*P（P）与TBHP+衣霉素处理的细胞相比，<0.05**P（P）与TBHP或衣霉素+TBHP处理的细胞相比，<0.01。C。LLC-PK1细胞用1μg/ml衣霉素（TN）预处理12 h，然后用10 mM 3-MA或50μg/ml氯喹处理1 h，然后再用10μM抗霉素a（ANTI-a）处理1 h。LDH释放试验作为细胞毒性指标。结果表示为四个不同实验的平均值±SEM*P（P）与抗霉素A或抗霉素+TN处理的细胞相比，<0.05**P（P）与TN+抗霉素A处理的细胞相比，<0.01。
图5
图5。与野生型MEF相比，土霉素预处理可保护Atg5-KO MEF免受氧化损伤和化学缺氧。
答：。野生型和Atg5-KO MEF用1μg/ml衣霉素预处理12 h，然后用200μM h处理2O（运行）2.H型2O（运行）2在指定的时间内给予治疗。LDH释放试验作为细胞毒性指标。结果显示为三个独立实验的平均值*P（P）与H相比<0.052O（运行）2-处理过的细胞。B。野生型和Atg5-KO MEF用1μg/ml衣霉素预处理12 h，然后用50μM TBHP处理。TBHP治疗在指定的时间内进行。LDH释放试验作为细胞毒性指标。结果代表三个独立实验的平均值**P（P）<0.01，以及***P（P）与TBHP处理的细胞相比，<0.001。C。野生型和Atg5-KO MEF在用10μM抗霉素A治疗前用1μg/ml衣霉素预处理12 h。LDH释放试验作为细胞毒性指标。结果表示三个独立实验的平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）与抗霉素A处理的细胞相比，<0.01。
图6
图6。衣霉素治疗不会影响肾细胞和肾脏的自噬流量。
答：。用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液均质从单独服用1 mg/kg体重衣霉素、50 mg/kg（体重）/天氯喹或衣霉素+氯喹治疗2d、3d和4d或溶媒（30%二甲基亚砜+70%盐水）治疗4d的小鼠肾组织。使用针对p62、LC3和β-肌动蛋白的特异性抗体对组织裂解物（50μg蛋白质）进行western blot分析。β-actin作为负荷对照。所示结果代表了三个独立的实验。B。用1μg/ml衣霉素（TN）、氯喹（CHL）和衣霉素+氯喹处理LLC-PK1细胞8h、16h和24h。用LC3和β-肌动蛋白特异性抗体对细胞裂解物（50μg蛋白）进行western blot。β-actin作为负荷对照。所示结果代表了三个独立的实验。
图7
图7。在肾缺血再灌注损伤期间，诱导Grp78对衣霉素给药和激活肾脏自噬的反应。
答：。用衣霉素（TN）或载体（30%二甲基亚砜+70%生理盐水）处理48小时的小鼠肾脏，按照方法进行免疫荧光染色。用多克隆兔Grp78抗体和抗兔Alexafluor-488标记的二级抗体对去蜡5μm切片进行免疫染色，并使用Olympus BX51荧光显微镜（40倍放大）记录图像。结果代表三个独立的实验。B。用衣霉素（TN）或载体（30%二甲基亚砜+70%盐水）处理48小时的小鼠肾组织用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液进行均质化。使用Grp78和β-肌动蛋白抗体对组织裂解物（50μg蛋白质）进行western blot分析。β-actin作为负荷对照。结果代表三个独立的实验。C。小鼠用衣霉素或载体（30%二甲基亚砜+70%生理盐水）治疗48小时，然后进行IR。在IR手术前1小时腹腔注射氯喹。按照方法所述，对肾脏进行免疫荧光染色。用多克隆兔抗LC3、抗兔Alexafluor-488标记的二级抗体对去蜡5μm切片进行免疫染色，并在奥林巴斯BX51荧光显微镜上以40倍放大率记录图像。结果代表三个独立的实验。D。小鼠用衣霉素或载体（30%二甲基亚砜+70%生理盐水）治疗48小时，然后进行IR。在IR手术前1小时腹腔注射氯喹。使用p62抗体对肾组织裂解物进行western blot分析。GAPDH被用作负荷控制。结果代表三个独立的实验。
图8
图8。先前内质网应激诱导的自噬可改善肾脏缺血再灌注损伤。
答：。小鼠在遭受IR损伤之前，给予1 mg/kg体重的衣霉素（TN）或载体（30%二甲基亚砜+70%盐水）2天。为了抑制自噬，在缺血前1 h给予50 mg/kg/天氯喹（CHL）。在指定时间测定BUN和血清肌酐。结果表示为平均值±SEM，n=5**P（P）BUN与单独IR相比<0.01**P（P）与单独IR相比，血清肌酐<0.01。B。肾脏组织学对溶媒（对照）、替尼霉素（3d TN）、氯喹（3d CHL）、缺血再灌注（IR 1d）、IR+TN和IR+TN+CHL的反应肾切片用PAS染色。结果代表三个独立的实验。
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