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.2015年10月1日；60(1):47-62.
doi:10.1016/j.molcel.2015.08.009。 Epub 2015年9月17日。

SPG7是线粒体通透性转换孔的基本和保守成分

Santhanam Shanmughapriya（桑塔纳姆·尚姆加布里亚） 1, 苏达尔桑·拉詹 1, 尼古拉斯·E·霍夫曼 1, 安德鲁·希金斯 1, Dhanendra Tomar公司 1, 内哈里卡·内马尼 1, 凯文·海因斯 1, 迪伦·史密斯 1, 江口明人 1, 桑迪亚山谷 1, 法拉·谢赫 1, 张曼玉（Maggie Cheung） 1, 尼科尔·伦纳德 1, 瑞安·斯托拉基斯 1, 马修·普·沃尔弗斯 1, 杰西卡·伊贝蒂 2, J Kurt Chuprun先生 2, Neelakshi R慢跑 1, 史蒂文·豪斯 三, 沃尔特·科赫 2, 约翰·W·埃尔罗德 2, 穆尼斯瓦米·马德什 4
附属公司

SPG7是线粒体通透性转换孔的基本和保守成分

Santhanam Shanmughapriya（桑塔纳姆·尚姆加布里亚）等。 分子电池. .

摘要

线粒体通透性转换是指线粒体通透性转换孔（PTP）突然打开，导致线粒体膜电位（ΔΨm）耗散、ATP生成损失和细胞死亡的现象。已经提出了几个候选基因来形成PTP复合体，但其核心成分尚不清楚。我们通过基于RNAi的筛选确定了痉挛性截瘫7（SPG7）在Ca（2+）和ROS诱导的PTP开放中的必要且保守的作用。SPG7的缺失导致线粒体Ca（2+）潴留增加，类似于亲环素D（CypD，PPIF）敲除，在Ca（2+）和ROS胁迫期间持续ΔΨm。生化分析表明，PTP是由VDAC、SPG7和CypD组成的异寡聚物。沉默或破坏SPG7-CypD结合可阻止Ca（2+）和ROS诱导的ΔΨm去极化和细胞死亡。本研究确定了一种普遍表达的IMM整合蛋白SPG7，作为OMM和IMM接触部位PTP的核心成分。

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数字

图1
图1。线粒体钙分子特性的表征2+-诱导PTP打开
（A）针对128个线粒体PTP候选基因稳定表达慢病毒Neg shRNA或shRNA的HEK293T细胞。X轴数字表示一个PTP候选击倒（KD）（见表S1）。条形图表示[Ca数量的量化2+]外面的线粒体（[Ca）处理的脉冲（10µM）2+]米压塌前ΔΨ米平均值±SEM。；n=3-4。另请参见图S1。（B）[Ca的代表性痕迹2+]外面的间隙（紫色）和ΔΨ米（橙色）。293T细胞稳定表达阴性shRNA（对照）。n=6。另请参见图S1。（C–P）[Ca的代表性痕迹2+]外面的间隙（紫色）和ΔΨ米（橙色）。14-25 Ca之间隔离PTP候选细胞的293T细胞稳定敲除2+ΔΨ之前的脉冲（10µM）米去极化。n=3-4。参见图S1和表S1。
图2
图2。沉默SPG7、PPIF和VDAC1可防止氧化剂依赖性PTP致敏
（A–O）[Ca的代表性痕迹2+]外面的带或不带H的间隙2O（运行）2（8 mM）预处理250秒。[加利福尼亚州2+]外面的脉冲和CCCP按指示发送。稳定表达Neg shRNA的293T细胞处理9个Ca2+脉冲（10µM），无H2O（运行）2预处理（黑色）和三脉冲H2O（运行）2预处理（蓝色）。对14名PTP候选人采用了类似的方案。n=3-4。（P）Ca数量的量化2+PTP候选者293T KD细胞中处理的脉冲（蓝色）或无H2O（运行）2（黑色）。平均值±SEM。；n=3-4。（问）条形图显示[Ca2+]米保持率（R（H2O（运行）2+钙2+)/钙2+). 平均值±SEM。；n=3-4。另请参见图S2。
图3
图3。SPG7直接绑定CypD
（A）用或不使用CsA（CsA；5µM）对HeLa细胞裂解液进行预处理，并用SPG7抗体进行免疫沉淀。使用IgG作为阴性对照。用SPG7（底部）和CypD（顶部）特异性抗体探测输入（左侧）和免疫沉淀（右侧）。n=5。（B）使用纯化的CypD和GST、SPG7-GST和AFG3L2-GST进行GST下拉分析的Western blot分析。GST蛋白作为阴性对照。输入（左）和谷胱甘肽sepharose-4B珠下拉样品（右）用GST（底部）和CypD（顶部）特异性抗体进行检测。n=4。（C）对表达CypD-HA、SPG7-HA或CypD-HA和SPG7-HA的COS-7细胞进行裂解，并用HA特异性抗体检测细胞裂解产物（左）。这些细胞裂解物在Superdex柱上分离，并用HA抗体对部分进行免疫印迹（右）。裂解表达AFG3L2-Flag或AFG3L2-Flag和CypD-Flag的COS-7细胞，分离细胞裂解物并用Flag抗体进行免疫印迹。左下面板指示CypD-Flag和AFG3L2-Flag的共存。n=3。（D）SPG7和CypD相互作用的酵母双杂交分析示意图。（E）全长SPG7及其功能域（FL-SPG7；顶部）和缺失N末端区域的截短SPG7（t-SPG7-（Δ270 aa）；底部）。（F）表达Myc-tagged Full-length SPG7（FL-SPG7）和Myc-tag t-SPG7的酵母裂解物的Western blot分析。n=3。（G）将全长SPG7和t-SPG7亚克隆到GBK载体中作为诱饵，将PPIF克隆到GAD载体中作为猎物。在相互作用后，表达GBK-tSPG7/GAD-CypD的酵母激活X-α-gal并产生蓝色菌落（三倍）。对于X-α-gal，GBK-FL-SPG7、GAD-CypD、pGBK-FL-SPG7/pGAD-CypD为阴性。n=3。（H）对从面板G中的X-α-gal活化阳性t-SPG7+CypD酵母细胞制备的裂解物进行免疫印迹分析，以检测HA（左）和Myc（右）。n=3。另请参见图S3。
图4
图4。SPG7 C-末端与CypD相互作用，SPG7蛋白水解活性对SPG7-CypD PTP功能是不必要的
（A）全长SPG7及其功能域（FL-SPG7）和截断SPG7（Δ1-Δ5-SPG7）。（B）表达CypD-HA/SPG7-Flag或CypD-HA/Δ1–5-SPG7-Flag和Flag（顶部）和HA（底部）免疫印迹的COS-7细胞的细胞裂解物（左侧）或免疫沉淀物质（右侧）。n=3。（C）具有其功能结构域的t-SPG7和用于Y2H测定的截短的t-SPG7（Δ1-Δ3-t-SPG7）。（D）来自共表达CypD-HA/t-SPG7-Myc或CypD-HA/Δ1–3 tSPG7-Myc的酵母细胞的裂解液，并对Myc（顶部）和HA（底部）进行免疫印迹。n=3。（E）如图3G所示，用GBK-t-SPG7/GAD-PPIF和GBK-Δ1–3t–SPG7/GAD-PPIF转化酵母并进行选择。X-α-半乳糖活化表现为三重蓝色菌落。对于X-α-gal.n=3，GBK-Δ3 t-SPG7/GAD-CypD为阴性。（F）t-SPG7（顶部）和t-SPG8蛋白水解酶域突变体（Mut1和Mut2 t-SPG6；底部）。（G）对共表达CypD-HA+t-SPG7-Myc、t-SPG7Mut1-Myc或t-SPG7 Mut2-Myc的酵母细胞的裂解液进行Myc（左）和HA（右）免疫印迹。n=3。（H）如图3G所示，用GBK-t-SPG7/GAD-PPIF、GBK-t-SPG7Mut1/GAD-PPIF和GBK-t-SPG7Mut2/GAD-PPIF转化酵母并进行筛选。X-α-半乳糖活化表现为三重蓝色菌落。n=3。（一）全长SPG7（顶部）和蛋白水解酶域突变体（Mut1和Mut2 FL-SPG7；底部）。（J）对表达CypD-HA+FL-SPG7-Flag、SPG7 Mut1-Flag或SPG7 Mut2-Flag的COS-7细胞的细胞裂解物（左侧）或免疫沉淀物质（右侧）进行Flag（顶部）和HA（底部）免疫印迹。n=4。（K）与图1B类似，[Ca的代表性痕迹2+]外面的间隙（黑色）和ΔΨ米（蓝色）。293T野生型（顶部）、SPG7 KD（中部）或稳定表达SPG7 Mut2的野生型细胞（底部）。n=3。另请参见图S4。
图5
图5。CypD、SPG7和VDAC1的相互作用在OMM和IMM接触点形成PTP复合体
（A）表达HA标记CypD和/或标记SPG7的COS-7细胞的细胞裂解物（左）或免疫沉淀物质（右）的Western blots。用CsA（5µM）预处理COS-7细胞裂解物，用HA抗体免疫沉淀，并对Flag（顶部）或HA（底部）进行免疫印迹。（n=4）。（B）来自表达HA标记的SPG7、Flag CypD野生型和Flag CypD-ΔCsA的COS-7细胞的细胞裂解物（左）或免疫沉淀物质（右）的蛋白质印迹。对HA-免疫沉淀材料进行Flag（顶部）或HA（底部）免疫印迹。（n=3）。（C）裂解表达CypD-ΔCsA-Flag（顶部）或CypD--ΔCs-Flag和SPG7-Flag的COS-7细胞，用Flag抗体对凝胶过滤柱部分进行免疫印迹。n=3。（D和E）与图1B类似，[Ca的代表性痕迹2+]外面的间隙（橙色）和ΔΨ米（棕色）。293T野生型（顶部）或野生型细胞稳定表达CypD-ΔCSA（底部）。n=3。（F）全长SPG7及其功能结构域的示意图（FL-SPG7）。FL-SPG7中的突变以红色突出显示（ΔS1、ΔS2和ΔS3）。（G）表达SPG7-Flag、VDAC1-HA和ΔS1-ΔS3-Flag的COS-7细胞的细胞裂解物（左）或免疫沉淀物质（右）的蛋白质印迹。HA抗体与VDAC1-HA共同免疫沉淀FL-SPG7-Flag和ΔS2-Flag。n=3。（H）裂解表达VDAC1-HA（顶部）或共表达VDAC1-HA和SPG7-HA（底部）的COS-7细胞，并用HA抗体对凝胶过滤柱部分进行免疫印迹。n=3。（一）稳定表达ΔS1-SPG7-Flag和ΔS2-SPG7-Flag的293T野生型或野生型细胞的Western blot分析。（J–L）与图1B类似，[Ca的代表性痕迹2+]外面的间隙（蓝色）和ΔΨ米（黑色）。293T野生型（J），稳定表达ΔS1-SPG7-Flag（K）或ΔS2-SPG7-Flag（K）的野生型细胞。n=3。另请参见图S5。
图6
图6。钙2+氧化剂诱导的PTP开放是一个SPG7/PPIF依赖过程
（A–C）[Ca的代表性痕迹2+]外面的250秒时，进行（蓝色）或不进行CSA（粉红色）（5µM）预处理的间隙。[加利福尼亚州2+]外面的脉冲和CCCP按指示发送。n=3。（D–F）Neg shRNA、SPG7 KD和PPIF KD细胞的线粒体膜完整性。然后用10µM Ca挑战渗透细胞2+500 s后的团注脉冲。然后，如图所示添加MCU阻滞剂Ru360（1µM）和CCCP（3µM。n=3。（G–I）从Neg shRNA、SPG7 KD和PPIF KD细胞中分离的线粒体与Ca孵育2+或叔丁基过氧化氢（100µM），并在540 nm处测量线粒体肿胀。用多项式拟合绘制平均值轨迹。n=3–6。（J）阴性shRNA、SPG7 KD和PPIF KD细胞在使用离子霉素（25µM；6小时）和H2O（运行）2（0.8 mM；6小时）处理。ΔΨ米使用TMRE作为指示剂进行测量。（K）线粒体TMRE荧光定量。平均值±SEM**p<0.01，***p<0.001，n=3–4。（左）钙调素淬灭试验用于评估钙诱导的PTP开放2+过载和氧化应激。Neg shRNA、SPG7 KD和PPIF KD细胞按J.钙调素处理，共聚焦显微镜检测钙调素荧光。（百万）线粒体钙黄绿素荧光定量。平均值±SEM**p<0.01，***p<0.001，n=3-4。另请参见图S6和S7。
图7
图7。CRISPR/Cas9介导spg7型敲除线粒体保持高[Ca2+]米并能抵抗细胞死亡
（A）CRISPR/Cas9-介导的基因分型策略spg7型HEK293T细胞中的KO。（B）典型的琼脂糖凝胶图像描述了预测的靶向PCR产物。（C和D）[Ca的代表性痕迹2+]外面的间隙（品红色）和ΔΨ米（绿色）野生型（左）和spg7敲除293T细胞（右）。（E）Western blot描述了SPG7敲除293T细胞中SPG7 Mut2的重建。（F）表达spg7蛋白水解酶域突变体2（spg7 Mut2）的spg7敲除293T细胞的代表性踪迹。n=3。（G）PI阳性细胞的细胞死亡定量。平均值±SEM*p<0.05，***p<0.001，ns，不显著。n=3-4。另请参见图S7。
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