Proteomic analysis of HIV-1 Gag interacting partners using proximity-dependent biotinylation

doi:10.1186/s12985-015-0365-6

.2015年9月11日12时138分。

doi:10.1186/s12985-015-0365-6。

利用邻近依赖性生物素化对HIV-1 Gag相互作用伙伴进行蛋白质组学分析

瓦莱丽·勒·塞奇¹, 亚历山德罗·辛蒂^2 三, 费尔南多·瓦利安特·埃切韦里亚^4 5 6, 安德鲁·穆兰^7 8

附属公司

¹HIV-1 RNA贩运实验室，Davis女士研究所，位于加拿大魁北克省Montreal，H3T 1E2，犹太综合医院。valerie.lesage@mail.mcgill.ca。
²HIV-1 RNA贩运实验室，Davis女士研究所，位于加拿大魁北克省Montreal，H3T 1E2，犹太综合医院。alessandro.cinti@mail.mcgill.ca。
^三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学医学系，H3A 0G4。alessandro.cinti@mail.mcgill.ca。
⁴HIV-1 RNA贩运实验室，Davis女士研究所，位于加拿大魁北克省Montreal，H3T 1E2，犹太综合医院。fvaliente@med.uchile.cl。
⁵加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学医学系，H3A 0G4。fvaliente@med.uchile.cl。
⁶现住址：智利独立大学医学院生物医学科学研究所病毒学项目分子和细胞病毒学实验室，智利圣地亚哥834100。fvaliente@med.uchile.cl。
⁷HIV-1 RNA贩运实验室，Davis女士研究所，位于加拿大魁北克省Montreal，H3T 1E2，犹太综合医院。andrew.mouland@mcgill.ca。
⁸加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学医学系，H3A 0G4。andrew.mouland@mcgill.ca。

PMID： 26362536
预防性维修识别码：项目经理4566291
内政部： 10.1186/s12985-015-0365-6

利用邻近依赖性生物素化对HIV-1 Gag相互作用伙伴进行蛋白质组学分析

瓦莱丽·勒萨奇等。维罗尔J. 2015.

.2015年9月11日12时138分。

doi:10.1186/s12985-015-0365-6。

作者

瓦莱丽·勒·塞奇¹, 亚历山德罗·辛蒂^2 三, 费尔南多·瓦利安特·埃切韦里亚^4 5 6, 安德鲁·穆兰^7 8

附属公司

¹HIV-1 RNA贩运实验室，Davis女士研究所，位于加拿大魁北克省Montreal，H3T 1E2，犹太综合医院。valerie.lesage@mail.mcgill.ca。
²HIV-1 RNA贩运实验室，Davis女士研究所，位于加拿大魁北克省Montreal，H3T 1E2，犹太综合医院。alessandro.cinti@mail.mcgill.ca。
^三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学医学系，H3A 0G4。alessandro.cinti@mail.mcgill.ca。
⁴HIV-1 RNA贩运实验室，Davis女士研究所，位于加拿大魁北克省Montreal，H3T 1E2，犹太综合医院。fvaliente@med.uchile.cl。
⁵加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学医学系，H3A 0G4。fvaliente@med.uchile.cl。
⁶现住址：智利独立大学医学院生物医学科学研究所病毒学项目分子和细胞病毒学实验室，智利圣地亚哥834100。fvaliente@med.uchile.cl。
⁷HIV-1 RNA贩运实验室，Davis女士研究所，位于加拿大魁北克省Montreal，H3T 1E2，犹太综合医院。andrew.mouland@mcgill.ca。
⁸麦吉尔大学医学系，魁北克省蒙特利尔市，H3A 0G4，加拿大。andrew.mouland@mcgill.ca。

PMID： 26362536
预防性维修识别码：项目经理4566291
内政部： 10.1186/s12985-015-0365-6

摘要

背景：人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）Gag多聚蛋白对于组装非感染性颗粒来说是必要的，也是足够的。鉴于HIV-1在其生命周期的所有阶段破坏了许多宿主蛋白，因此必须将这些相互作用确定为抗逆转录病毒治疗的潜在靶点。

调查结果：这项工作证明了近距离依赖生物素鉴定（BioID）在宿主蛋白和与HIV-1 Gag多聚蛋白N末端结构域近的复合物中的应用。BioID屏幕中识别的两个点击通过免疫沉淀进行验证，并确认DDX17和RPS6与HIV-1 Gag的相互作用。

结论：我们的结果表明，BioID是在不同细胞系复制周期中筛选HIV-1 Gag附近相互作用蛋白的一种成功且互补的方法。

PubMed免责声明

数字

图1
重组HIV-1 Gag的表达与定位。一单独编码MYC标记的BirA*和与HIV-1的N末端融合的MYC-BirA*的表达盒的图。b条将BirA*或BirA*-Gag转染Jurkat或HeLa细胞24小时。使用抗MYC（US Biological Life Sciences，M9601-30）、抗p24（NIH，183-H12-5C）和抗肌动蛋白（Abcam，ab8226）抗体通过Western blot评估BirA*和BirA*-Gag的表达水平。**c（c）**用BirA*、BirA*-Gag或HIV-1外显质粒（pNL4-3）转染的Jurkat（左图）或HeLa（右图）细胞的免疫荧光。将副甲醛固定细胞与一级抗MYC和抗p24抗体以及二级抗体Alexa Fluor 488抗小鼠IgG和Alexa Fluor 594抗兔IgG（分子探针）孵育1小时。使用DAPI将盖玻片安装在ProLong Gold防褪色试剂（分子探针）中，以对细胞核进行染色。图像是使用63x物镜的Wave-FX旋转圆盘共焦显微镜采集的。比例尺指示10μm

图2
确定潜在的Gag近端和交互伙伴。在添加50μM生物素（Sigma）的培养基中用BirA*或BirA*-Gag转染Jurkat细胞。转染后24小时收集细胞裂解物。如制造商所述，使用Dynabeads MyOne Streptavidin C1（生命技术）从1 mg裂解液中沉淀生物素化蛋白。洗脱后的蛋白质在4-15%SDS-PAGE（Bio-Rad）上分离，条带切除后由卡尔加里大学SAMS蛋白质组学中心的LC-tandem MS分析。一描述Gag相互作用蛋白之间重叠点击数的维恩图。b条根据基因家族和亚家族在生物过程、分子功能和蛋白质类别三个不同方面的功能，使用PANTHER对其进行分组和分类。**c（c）**GeneMANIA（用于自动选择权重方法）用于确定输入基因之间的已知交互作用及其交互方式。网络中基因之间的关系包括物理和遗传相互作用、通路和蛋白质结构域相似性

图3
通过免疫沉淀和Western blot验证BirA*-Gag相互作用。Gag编码序列被克隆到pCI-Neo-Flag（Flag）（Life Technologies）中*XhoI公司*和*不是我*表达Flag-Gag。用GFP或Gag-GFP（左面板）或Flag或Flag-Gag（右面板）转染HeLa细胞24小时。用PBS清洗细胞裂解液，并使用添加了完整蛋白酶抑制剂（罗氏）的NP40裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.8；150 mM NaCl；0.5 mM EDTA；0.5%Nonide P-40）收集细胞裂解液。通过Bradford分析（Bio-Rad）对细胞裂解物进行量化，并按照制造商（MLB）的说明，用抗MYC标记单克隆抗体磁性珠免疫沉淀1 mg蛋白质2 h。用抗p24（NIH，183-H12-5C）、抗DDX17（Abcam，ab24601）和抗S6核糖体蛋白（Cell Signaling 54D2）抗体通过SDS-PAGE分析结合复合物

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