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.2015年4月13日；10（4）：e0122994。
doi:10.1371/journal.pone.0122994。 电子收集2015。

SupT1细胞的蛋白质组分析揭示了HIV-1 Nef变异体对宿主蛋白的调节

瑞舒·萨塞纳 1, 苏迪普蒂·古普塔 1, 卡维塔·辛格 2, 卡利安·米特拉 2, 阿尼尔·库马尔·特里帕蒂 三, 拉杰·卡迈尔·特里帕西 1
附属公司

SupT1细胞的蛋白质组分析揭示了HIV-1 Nef变异体对宿主蛋白的调节

Reshu Saxena公司等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

Nef是一种辅助病毒蛋白，可促进HIV-1的复制，通过多种蛋白质-蛋白质相互作用促进细胞途径的改变。蛋白质组学的出现扩大了人们对更好地识别调控疾病进展的新分子途径的关注。在这项研究中，对随机选择的患者进行nef测序，然而，确定的序列变异性并没有引发任何特定突变，这些突变可能会将处于不同疾病进展阶段的HIV-1患者隔离开来。为了探索基于序列变异性的Nef功能的差异，我们使用了蛋白质组学方法。进行蛋白质组分析以比较Nef变体对宿主细胞蛋白质表达的影响。对照组和Nef转染的SupT1细胞中的2DGE显示了几种差异表达的蛋白质。检测到14个蛋白质斑点，差异超过1.5倍。Nef处理的细胞中有六个独特的蛋白质点显著下调。通过LC-MS/MS鉴定为亲环蛋白A、EIF5A-1亚型B、Rho GDI 1亚型A、VDAC1、OTUB1和α-烯醇化酶亚型1（ENO1）。通过实时PCR、Western blotting和免疫荧光研究，利用两种Nef变异体（RP14和RP01）分析了这6种蛋白在SupT1细胞中的差异表达。这些Nef变异体对这六种蛋白质表达的影响存在差异。Nef RP01对α-烯醇化酶（ENO1）、VDAC1和OTUB1的下调作用更为显著，而Nef RP14对亲环素A和RhoGDI的下调作用更强。还通过Nef RP01的定点突变（55AAAAAAA61）研究了Nef变异体对宿主蛋白表达的这种差异，发现这种影响是相反的。解读这些由Nef变异体介导的蛋白质的作用将为理解Nef介导的发病机制开辟一条新的研究途径。总体研究确定了HIV-1 Nef变异体对T细胞中细胞蛋白表达的调节。

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数字

图1
图1。HIV-1 Nef（RP14）与Nef（RP 01）的序列比对：RP14和RP01蛋白翻译序列分别以红色和蓝色显示。
蓝色的21–30是RP14中的九个氨基酸插入，而RP01的55–61是RP14的七个氨基酸缺失的位置。常见的氨基酸用星号标出，而有差异的氨基酸在对齐时用圆点表示。
图2
图2。Nef转染后SupT1细胞的蛋白质组特征。
（a）载体（pYFP-N1）转染SUPT1细胞与（b）Nef RP14转染细胞的二维凝胶电泳图像。pI量表是根据线性pH梯度条带的尺寸（pH值范围3–10线性超过13cm）构建的。红色圆圈表示斑点显示差异表达。Nef转染细胞中显示主要下调的斑点标记为25、31、98、125、157和244号斑点。（c） 面板显示斑点的放大截面及其相对斑点密度和3D峰面积。结果表示为平均6 SEM，n=3。通过Student t检验评估治疗组和对照组之间的蛋白质点密度差异。pH从左到右增加，分子量从凝胶的顶部到底部减少。
图3
图3。用qPCR检测Nef诱导的6个基因的转录改变。
实时RT-PCR分析6个基因的表达。Nef转染后表达的折叠变化与对照组相比。除VDAC1外，所有5个基因均被Nef变异体下调。数值和误差条表示三组独立实验的平均值和标准偏差。进行学生T检验，以找出对照组和治疗组之间的显著差异。
图4
图4。LC-MS/MS鉴定蛋白质的Western blot确认。
典型蛋白质的Western blotting显示出与2DGE分析相似的定量特征。Nef变异体对六种蛋白表达的对比作用-亲环素A、EIF5A-1、Rho-GDI、VDAC1、OTUB1和ENO1。α-微管蛋白作为负荷对照。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。
图5
图5。SupT1细胞的免疫荧光染色显示下调蛋白的比较表达。
通过共聚焦显微镜在40倍和63倍放大下捕获用于比较SupT1细胞（1μm切片）中六种蛋白的细胞表面表达的免疫荧光研究。图中显示了表达Vector/Nef（绿色）的免疫荧光SupT1细胞，以及各自的蛋白质（红色），其细胞核用DAPI染色（蓝色）。对每个样本的6个不同区域的5-8个Nef/载体转染细胞的荧光强度进行测量，并计算平均值。数据以两个不同实验的值表示。图5显示了ENO1和VDAC1（A-C）以及EIF5A、OTUB1、CYPA和RhoGDI（D-H）。
图6
图6。Nef RP01（55AAAAAAA61）突变体的Western blotting分析。
（A） Western blot显示Nef RP01突变体对Nef RP01-引起的α-烯醇化酶（ENO1）和VDAC1下调的逆转作用。Alpha-tubulin被用作负荷控制。（B） 表示Nef RP14 Nef RP01和Nef RP01-突变对α-烯醇化酶（ENO1）和VDAC1表达影响差异的图。数据表示为两个独立实验的平均值±SD。
图7
图7。已鉴定的Nef下调蛋白的蛋白-蛋白相互作用。
在STRING中创建了亲环蛋白A、EIF5A-1、Rho GDI、VDAC1、OTUB1和ENO1及其顶级合作伙伴的预测网络图，以及与HIV-1 Nef的关联。盒子中的蛋白质是我们工作中确定的低表达蛋白质。其余蛋白质是数据库中的宿主蛋白质。黄色标记的蛋白质是Nef，已知与亲环素A、RAC1、CDC42和BCL2L1（与红线相连）的相互作用，如HIV-1人类蛋白质相互作用数据库所示。
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引用人

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工具书类

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赠款和资金

作者感谢“科学与无差别研究委员会（CSIR）-中央药物研究所（CDRI）”提供的机构资金和CSIR网络项目“深入研究”（BSC0111）提供的资金支持。RS感谢ICMR的奖学金支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。