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.2014年12月20日；21(18):2469-82.
doi:10.1089/ars.2014.5856。 Epub 2014年7月29日。

低氧反应microRNA-101通过靶向cullin 3通过血红素氧化酶-1/血管内皮生长因子轴促进血管生成

Ji-Hee Kim先生 1, Kwang-Soon Lee（李光顺）, 李东健, Joohwan Kim先生, Su-Nam Kwak公司, 权秀哈, 琼森·崔, 穆胡元, Byung Ryul Cho（赵炳良）, Dooil Jeoung公司, Hansoo Lee公司, Young-Guen-Kwon先生, Young-Myeong Kim（金永明）
附属公司

低氧反应microRNA-101通过靶向cullin 3通过血红素氧化酶-1/血管内皮生长因子轴促进血管生成

Ji-Hee Kim先生等。 抗氧化剂氧化还原信号. .

摘要

目的：缺氧诱导调节血管生成和血管功能的各种基因和微RNA（miRs）的表达。在本研究中，我们研究了新的缺氧反应性miR-101在血管生成中的新功能作用及其调节血红素加氧酶-1（HO-1）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的潜在机制。

结果：我们发现缺氧诱导miR-101与cullin 3（Cul3）的3'非翻译区结合，并通过抑制蛋白酶体降解途径稳定核因子-红细胞衍生2相关因子2（Nrf2）。miR-101过度表达促进了Nrf2核积累，同时伴随着HO-1诱导、VEGF表达和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）衍生的一氧化氮（NO）生成的增加。NO-诱导的Kelch-like ECH-associated protein 1的S-亚硝基化升高以及随后诱导的Nrf2依赖HO-1导致通过Nrf2/HO-1和VEGF/eNOS轴之间的正反馈回路进一步提高VEGF的生成。此外，miR-101在体内外均可促进血管生成信号和血管生成，这些事件通过抑制HO-1、VEGF或eNOS的生物活性而减弱。此外，在HO-1（+/-）和eNOS（-/-）小鼠的主动脉环中也观察到这些作用。miR-101的局部过表达改善了缺血小鼠后肢的治疗性血管生成和灌注恢复，而antagomiR-101减少了局部血流量。

创新：低氧反应miR-101通过Cul3靶向激活HO-1/VEGF/eNOS轴来刺激血管生成。因此，miR-101是一种新型血管抑制剂。

结论：我们的结果为miR-101作为血管生成和血管重塑的潜在治疗靶点的功能作用提供了新的机制性见解。

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数字

<b>图1</b>
图1。
缺氧诱导miR-101上调，其靶向内皮细胞中的Cul3。（A）HUVECs、HBMECs、人类原代AC、HeLa细胞和U937细胞在常氧（N）和缺氧（H）条件下维持。通过qRT-PCR测定miR-101的表达水平。（B）在暴露于常氧和缺氧的HUVEC中测定miR-101水平的时间进程。（C）转染对照或HIF-1αsiRNA的细胞在常氧和缺氧条件下保持不变，并对miR-101水平进行量化。（D）,E）用antagomiR-101（Ant-101）或对照antagomi R（C-Ant）转染细胞，并在常氧或缺氧条件下维持12 h。通过qRT-PCR和Western blotting测定Cul3和HO-1的表达水平。（F）使用psiCHECK™-2/Cul3 3′UTR双酶报告分析系统测定Cul3 3′的UTR活性。图中所示数据为平均值±SD(n个=3）*第页<0.05和**第页<0.01. 3′UTR，3′非翻译区；AC、星形胶质细胞、Cul3、cullin3；HBMEC，人脑微血管内皮细胞；缺氧诱导因子-1α；血红素氧化酶-1；人脐静脉内皮细胞；miRNA，miR，microRNA；qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应；SD，标准偏差。
<b>图2</b>
图2。
miR-101通过靶向Cul3上调Nrf2依赖性HO-1的表达。将pSilencer 2.1-U6/pre-miR-101（miR-101）、pSilence 2.1-U6/control pre-miR（C-miR）或p3xFLAG-CMV10-Cul3或与含有Cul3野生型或突变型3′UTR的psiCHECK™-2载体联合转染HUVEC，然后在新鲜培养基中培养12小时。（A）采用双核糖核酸酶报告法测定Cul3′UTR活性。（B）通过RT-PCR和Western blotting测定Cul3和HO-1的表达水平。（C）用5μM MG132处理细胞4h后，免疫沉淀后用Western blotting检测泛素化Nrf2。（D）在指定的时间段内，用0.5μg/ml放线菌素D处理细胞。通过Western blot分析测定Nrf2蛋白水平。所示数据是两个单独实验的平均值。（E）用Keap1抗体免疫沉淀细胞裂解物。通过Western blotting检测Keap1和Nrf2之间的相互作用。（F）用免疫组织化学方法检测完整细胞中的Nrf2核转位。比例尺：25μm。（G）通过ChIP分析确定Nrf2与HO-1启动子抗氧化反应元件的特异性结合。（H）HO-1启动子活性用荧光素酶-碱性分析系统测定。条形图中显示的数据为平均值±SD(n个=3). *第页<0.05和**第页<0.01. ChIP，染色质免疫沉淀；Keap1，kelch-like ECH-associated protein 1；核因子红细胞衍生2相关因子2；miR-101前体、miR-101前体；RT-PCR，逆转录聚合酶链反应。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为网址：www.liebertpub.com/ars
<b>图3</b>
图3。
miR-101增加HIF-1α介导的VEGF表达 通过 HO-1通路的诱导。用pSilencer 2.1-U6/mir-101（或pSilence 2.1-U6/C-mir）或与对照siRNA（siCtrtl）、HO-1 siRNA（siHO-1）或pGL3-VEGF-Luc联合转染HUVEC 24小时，然后用或不用SnPP处理12小时。（A）通过RT-PCR和Western blotting测定HO-1和HIF-1α的表达水平。（B）用5μM MG132处理12 h的HUVEC细胞裂解液中检测HIF-1α泛素化。（C）通过测定细胞裂解液中PHD活性[35S] 蛋氨酸标记的VHL蛋白和纯化的GST-ODD结构域。（D）用HSP90抗体免疫沉淀后测定HSP90和HIF-1α之间的相互作用。（E）在蔗糖密度梯度上对细胞裂解物进行超离心。在254 nm处测定收集部分的吸光度曲线。（F）在16至22个组分的样品中测定多聚体结合HIF-1αmRNA的水平。数值代表平均值±SD(n个=3). **第页<0.01.（G）免疫组织化学检测HIF-1α核转位。比例尺：25μm。（H）荧光素酶报告活性（平均值±SD，n个=3）在转染pGL3-VEGF-Luc的HUVECs中进行分析**第页<0.01.（一）通过RT-PCR和Western blotting测定VEGF表达水平。GST-ODD，谷胱甘肽S公司-转移酶-氧依赖性降解；热休克蛋白90；脯氨酰羟化酶结构域蛋白；SnPP，锡-丙卟啉IX；血管内皮生长因子；VHL，von Hippel–林道。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertpub.com/ars
<b>图4</b>
图4。
miR-101通过以下途径扩增VEGF表达 S公司-亚硝化Keap1。转染含有mir-101或C-mir的pSilencer 2.1-U6载体的HUVECs分别与SnPP、抗VEGF抗体（α-VEGF）和L-NAME培养。（A）细胞内NO水平（平均值±SD，n个=3）使用4-氨基-5-甲氨基-2′，7′-二氟荧光素通过共焦显微镜进行测定**第页<0.01.（B） S公司-Keap1的硝化作用用S公司-亚硝化蛋白检测试剂盒。（C）Keap1和Nrf2抗体免疫沉淀后，通过Western blotting检测Keap1与Nrf2之间的相互作用。（D）荧光素酶活性（平均值±SD，n个=3）在转染pGL3-HO-1-Luc细胞的裂解液中进行分析*第页<0.05。（E）通过Western blotting测定HO-1、HIF-1α和VEGF蛋白水平。（F）免疫组织化学法检测HIF-1α的核蓄积。比例尺：25μm。L名称，N个G公司-硝基-我-精氨酸甲酯；NO，一氧化氮。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertpub.com/ars
<b>图5：</b>
图5：。
miR-101刺激血管生成 通过 HO-1介导的VEGF表达。用pSilencer 2.1-U6/mir-101或pSilence 2.1-U6/C-mir或与对照或HO-1 siRNA联合转染HUVEC 24 h，并用或不用SnPP和抗VEGF抗体处理。（A）通过Western blot分析测定血管生成信号分子的磷酸化。（B）,C）细胞增殖、迁移和管形成由[三H] -胸腺嘧啶掺入试验、博伊登室试验和相控显微镜。数据表示平均值±SD(n个=3). *第页<0.05和**第页<0.01与单独使用miR-101。（D）野生型HO-1主动脉环+/−、和eNOS−/−用携带mir-101或C-mir的慢病毒转导小鼠，然后在Matrigel平板上使用或不使用SnPP和抗VEGF抗体治疗18天。从主动脉环边缘定量内皮发芽面积。数据表示平均值±SD(n个=每组6–8个主动脉环，每个小鼠制备两个主动脉环）*第页<0.05和**第页<0.01.（E）,F）将携带mir-101或对照mir（C-mir）的慢病毒转染的HUVEC与Matrigel混合并皮下植入裸鼠体内。7天后收获基质塞。（E）代表性照片和（F）血红蛋白定量。数据表示平均值±SD(n个=4) **第页<0.01. eNOS、内皮一氧化氮合酶。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertpub.com/ars
<b>图6</b>
图6。
低氧反应miR-101增加缺血小鼠后肢的新生血管和血流恢复。（A）,B）在手术后24和48小时，从股动脉阻断和羞愧的小鼠中获取腓肠肌。miR-101水平(A类)和Cul3 mRNA(B类)通过qRT-PCR测定(n个=每组5只小鼠）。(C类)通过Western blotting测定Cul3、Nrf2、HO-1和VEGF代表性蛋白水平。（D）–G）对小鼠进行股动脉结扎，然后注射含有mir-101或对照mir（C-mir）、antagomiR-101（Ant-101）或对照antigomiR（C-Ant）的慢病毒(n=5每组）。（D）小鼠后肢缺血后第0天和第21天的典型激光多普勒灌注成像。（E）量化血流恢复。（F）典型的免疫荧光图像显示缺血小鼠后肢腓肠肌横切面上CD31阳性毛细血管。比例尺：50μm。（G）血管密度的量化。图中显示的数据表示平均值±SD*第页<0.05和**第页<0.01. 要想看到这幅彩色插图，读者可以参考本文的网络版，网址为www.liebertpub.com/ars
<b>图7</b>
图7。
miR-101促进血管生成的示意图低氧升高miR-101的表达，miR-101与Cul3 mRNA的3′UTR结合。Cul3水平降低激活Nrf2/HO-1轴，然后降解血红素产生CO、胆绿素和胆红素。这些产物导致HIF-1α稳定和VEGF表达。有一个正反馈电路来放大Nrf2/HO-1通路通过VEGF/eNOS/NO-依赖性S公司-Keap1的亚硝化。一氧化碳。
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