Comprehensive analysis of RNA-protein interactions by high-throughput sequencing-RNA affinity profiling

doi:10.1038/nmeth.2970

.2014年6月；11(6):683-8.

doi:10.1038/nmeth.2970。 Epub 2014年5月8日。

通过高通量序列分析RNA亲和力谱综合分析RNA-蛋白质相互作用

雅各布·M·汤姆¹, 阿卜杜拉·奥泽¹, 约翰·帕加诺², 丹·盖巴^三, 加里·普·施罗斯^三, 约翰·特里斯²

附属公司

¹1] 美国纽约州伊萨卡康奈尔大学分子生物学和遗传学系[2]。
²美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学分子生物学与遗传学系。
^三Illumina，Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥。

PMID： 24809628
PMCID公司：项目经理4073888
内政部： 10.1038/nmeth.2970

通过高通量序列分析RNA亲和力谱综合分析RNA-蛋白质相互作用

雅各布·M·汤姆等。 Nat方法. 2014年6月.

.2014年6月；11(6):683-8.

doi:10.1038/nmeth.2970。 Epub 2014年5月8日。

作者

雅各布·M·汤姆¹, 阿卜杜拉·奥泽¹, 约翰·帕加诺², 丹·盖巴^三, 加里·普·施罗斯^三, 约翰·特里斯²

附属公司

¹1] 康奈尔大学分子生物学和遗传学系，美国纽约伊萨卡[2]。
²美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学分子生物学与遗传学系。
^三Illumina，Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥。

PMID： 24809628
PMCID公司：项目经理4073888
内政部： 10.1038/nmeth.2970

摘要

RNA-蛋白质相互作用在基因调控中起着关键作用，但缺乏大规模定量分析这些相互作用的方法。我们通过使用高通量DNA测序器来量化荧光标记蛋白与数百万锚定在测序cDNA模板上的RNA的结合，开发了高通量测序RNA亲和力分析（HiTS-RAP）。利用HiTS-RAP，我们测量了GFP-结合和NELF-E结合适配体的突变文库对其各自靶点的亲和力，并确定了相互作用的关键区域。突变还会影响NELF-E结合适配体的亲和力，其相互作用主要依赖于单链RNA基序，而不依赖于GFP适配体，后者的相互作用主要取决于二级结构。

PubMed免责声明

数字

**图1。用Tus终止T7 RNA聚合酶，得到含有DNA和功能RNA的稳定复合物**
(a。)EMSA是用放射标记DNA进行的，该DNA编码GFP适配体，并具有Tus的结合位点。裸DNA具有高流动性。将Tus与ter-DNA元素（红色片段）结合会延缓DNA的流动性。转录后，几乎每个DNA都参与了一个中间迁移复合体，包括Tus、T7 RNA聚合酶（橙色）和RNA（绿色）。该条带非常清晰，表明每个DNA-Tus-T7RNAP-RNA复合物的组成都是均匀的。b。454生命科学聚苯乙烯珠，覆盖共价连接DNA模板用于转录。转录停止后，用EGFP孵育珠子，然后清洗。EGFP与呈现暂停GFP适配体RNA的珠子结合，但不与呈现SRB-2适配体RNA.比例尺为20μm。

**图2。HiTS-RAP可以在Illumina GAIIx仪器上分析RNA与蛋白质的相互作用**
(一)HiTS-RAP示意图。按照标准Illumina工作流进行排序。然后剥离测序期间合成的链，退火引物，并用Klenow酶再生第二链。然后将Tus绑定到ter位点，并转录流动细胞上的DNA。T7 RNAP在其启动子处启动，通过感兴趣的序列转录，并在Tus结合位点的上游停止。RNA转录物通过聚合酶与DNA模板稳定连接。荧光标记的蛋白质随后与RNA结合并成像。(b条)HiTS-RAP运行GFP和SRB-2适配体的图像。”所有簇（左侧面板）在测序过程中都会标记，并显示为四个通道的最大强度投影。在转录暂停和EGFP-mOrange结合后，流细胞在625 nM EGFP-mOrange下成像。GFPapt簇用mOrange标记，而SRB-2适配体簇没有标记。比例尺：6.75μM，嵌入1.125μM(**c（c）**)GFP适配体的结合曲线(*n个=*2665064）和突变体C58U(*n个=*3833），C76U(*n个=*4758）和G8U_U56C(*n个=*29）和SRB-2适配体(*n个=*1,588,404). G8U_U56C和SRB-2适配体评分为不结合。数据来自测序器的一条通道（SRB-2适配子来自一条单独的通道）。强度是车道中每个序列的所有簇的平均值，通过除以它们的平均排序强度并减去它们在无EGFP-mOrange时的平均强度进行标准化。误差条表示标准误差。安装的错误*K（K）_d日*s是拟合算法返回的方差的平方根。(d日)c部分RNA的EMSA。*K（K）_d日*s是从单个拟合到每个序列的两个重复EMSA实验中确定的，±标准偏差由IGOR拟合。G8U_U56C凝胶也被扫描以可视化EGFP。

**图3。用HiTS-RAP分析GFPapt**
(一)所有236个测得的GFPapt单点突变体的GFP结合亲和力。以nM为单位的结合亲和力以对数标度绘制。每个位置的突变都是彩色编码的。野生型GFPapt绑定亲和力由彩色虚线表示，序列显示在图形底部。误差条表示日志中的标准偏差(*K（K）_d日*). 175个突变体在所有三个通道中都具有约束力。单点突变体符合无约束力的条件，因此在至少一条车道上具有125 nM的亲和力，用开放的圆圈绘制，没有误差线。那些在所有车道上都不绑定的位于地块顶部。(b条)预测GFPapt的二级结构。GFPapt预计会折叠成一个三杆环结构，由一个中央三通接头连接。每个位置都由平均绝对效果|log着色₂(*K（K）_d日*_{_多用途终端}/*K（K）_d日*_{_重量})|在所有经过测量的突变体中。符合非结合条件的突变被赋予125 nM的亲和力。平均效应大于4（亲和力大于16倍）的位置为红色。除C58U和U60A（用星号表示）外，大多数突变对结合亲和力具有负效应或小于2倍的正效应。(**c（c）**)GFPapt双突变体的测量和预测效果之间的相关性。测量的对数₁₀(*K（K）_d日*_{_穆特1_2}/*K（K）_d日*_{_重量})相对于基于单点突变体预测的值绘制（log₁₀(*K（K）_d日*_{_静音1}/*K（K）_d日*_{_重量})+日志₁₀(*K（K）_d日*_{_多功能电视2}/*K（K）_d日*_{_重量})). 根据测量的效果和预测的效果之间的差异对点进行着色。有一个正相关但很小的关系（r²=0.10），两者相差1.98倍或约100倍。

**图4。利用HiTS RAP分析NELFapt**
(一)206个NELFapt单点突变体的NELF-E结合亲和力。以nM为单位的结合亲和力以对数标度绘制。图底部显示的突变和标准适配体序列如图3a所示着色。(b条)预测NELFapt的二级结构。据预测，NELFapt有两个干环，通过环式结构连接在其间。预测的二级结构如图3b所示绘制并着色。大多数突变显示不到2倍的效应（对数₂(*K（K）_d日*_{_多用途终端}/*K（K）_d日*_{_重量})≤1）结合亲和力。(**c（c）**)NELFapt双突变体的测量和预测效果之间的相关性（n=2442）。如图3c所示，根据单突变预测的折叠效应绘制双突变的测量折叠效应。在这种情况下，有很强的正相关性（r²=0.87）。

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