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.2013年10月8日；110（41）：E3945-54。
doi:10.1073/pnas.1309991110。 Epub 2013年8月27日。

Polo-like kinase 2调节选择性自噬α-synuclein清除并抑制其体内毒性

阿比德·乌斯拉蒂 1, 伯纳德·施耐德, 帕特里克·埃比舍尔, Hilal A Lashuel公司
附属公司

Polo-like kinase 2调节选择性自噬α-synuclein清除并抑制其体内毒性

阿比德·乌斯拉蒂等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

由于基因重复/三倍体或降解受损，α-突触核蛋白水平增加足以触发其聚集并导致家族性帕金森病（PD）。因此，降低α-突触核蛋白水平是治疗PD和相关突触核细胞病的可行治疗策略。在这里，我们报道了Polo-like kinase 2（PLK2），一种在同核蛋白病患者大脑中上调的酶，以激酶活性依赖的方式与磷酸化并增强α-同核蛋白自噬降解。PLK2介导的α-突触核蛋白降解需要S129处的磷酸化和PLK2/α-突触核蛋白复合物的形成。在PD大鼠遗传模型中，PLK2过度表达可减少神经元内人类α-突触核蛋白的积累，抑制多巴胺能神经变性，并逆转α-突触核蛋白过度表达诱导的偏侧帕金森病运动障碍。PLK2介导的神经保护作用也依赖于PLK2活性和α-突触核蛋白磷酸化。总之，我们的研究结果表明，PLK2是以前未描述的α-突触核蛋白周转的调节器，调节其激酶活性可能是治疗突触核细胞病的可行靶点。

关键词：腺相关病毒；动物模型；血清诱导激酶。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：这项工作得到了盈利公司默克塞罗诺公司（Merck Serono S.A.）的部分支持。

数字

图1。
图1。
在基于细胞的分析中，PLK2过度表达增强了α-syn自噬介导的降解。(A类)Western blot和量化转染人α-syn（1µg）和增加PLK2 WT（0.5、1和2µg。对于DNA滴定，每次转染的总DNA通过添加pcDNA空载体来平衡。PLK2的过度表达导致α-syn蛋白水平的浓度依赖性降低。使用针对α-syn不同表位的抗体检测α-syn-排除了表位识别缺失的可能性(**P（P）< 0.01). (B类)全细胞裂解物形成HEK细胞，转染α-syn（1µg）和PLK2 WT（0.5μg），并用蛋白酶体抑制剂（50 nM Epoxomicin和10µM MG132）和自噬-溶酶体抑制剂（10 mM 3MA和25 mM NH）处理4Cl）。Western blot和光密度定量显示，只有自噬溶酶体抑制剂能够逆转PLK2诱导的α-syn的减少(**P（P）< 0.01). (C类)全细胞裂解物分析和光密度定量显示PLK2过表达后β-突触核蛋白（β-syn）降解(**P（P）< 0.01). (D类)全细胞裂解物分析和光密度定量显示GFP水平不受PLK2过度表达的影响。
图2。
图2。
PLK2过度表达而非GRKs介导HEK239T细胞中的α-syn降解。(A类)全细胞分析和蛋白质印迹显示用α-syn和PLK2或GRK（GRK3、GRK5和GRK6）转染的HEK细胞中总α-syn和pS129的水平。(B类)α-syn信号的光学密度定量显示，只有PLK2的过度表达才会导致α-syn-水平的降低。有趣的是，GRK5和GRK6诱导α-syn信号增加(*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01). (C类)相对于总α-syn信号，pS129水平的光学密度定量显示了PLK2在细胞培养中磷酸化α-syn方面的优势(**P（P）< 0.01).
图3。
图3。
PLK2/α-syn复合物的形成是PLK2介导的α-syn-转换所必需的。(A类)在有或无ATP的情况下，α-syn和PLK2的协同免疫沉淀表明，需要ATP的存在才能稳定PLK2和α-syn-蛋白-蛋白质的相互作用。(B类)α-syn（WT和S129A）与PLK2（WT与KDM）的共免疫沉淀表明，α-syn-磷酸化位点S129和PLK2激酶结构域的完整性对PLK2/α-syn.相互作用很重要。(C类)α-syn和PLK2在β-syn或SPAR存在下的协同免疫沉淀，表明这两种PLK2底物之一的存在与α-syn-竞争与PLK2的相互作用，并降低PLK2/α-syn-co免疫沉淀。(D类)转染人α-syn（1µg）、PLK2 WT（0.5µg。对于DNA滴定，每次转染的总DNA通过添加pcDNA空载体来平衡。Western blot显示，β-syn的过度表达逆转了α-syn转换，而不影响pS129/α-syn-水平(*P（P）< 0.05). (E类)转染人α-syn（1μg）、PLK2 WT（0.5μg）和增加数量的SPAR（1.5和3μg）的HEK细胞的全细胞裂解物。对于DNA滴定，通过添加空的pcDNA空载体来平衡每次转染的总DNA。Western blot结果显示，SPAR的过度表达逆转了α-syn的转换，而不影响pS129/α-syn的水平(*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01).
图4。
图4。
PLK2激酶活性是PLK2介导的α-syn转换所必需的。(A类)全细胞裂解物Western blot和(B类)光密度分析表明，PLK2 KDM的过度表达并没有诱导α-syn转换。(C类)全细胞裂解物Western blot和(D类)光学密度分析表明，使用ATP-竞争性抑制剂BI2536（10µM）抑制PLK2激酶活性，可降低pS129水平并抑制PLK2-介导的α-syn转换(**P（P）< 0.01).
图5。
图5。
PLK2 WT过度表达（而非KDM）诱导S129处α-syn磷酸化，并降低神经元内α-syn-蛋白水平。(A类)显微照片显示注射大脑中α-syn和PLK2的表达。（比例尺：50µm）(B类)α-syn和PLK2在共同感染的多巴胺能神经元中共同定位的高倍图。（比例尺：5µm）(C类)α-syn和pS129的免疫荧光显示与PLK2 WT共表达后pS129水平增加。（比例尺：100µm）(D类)与总α-syn相比，pS129水平的光学密度定量，估计α-syn-与PLK2 WT共表达后pS129的水平增加了三倍，并用直方图说明pS129相对于总α-sny的水平。(E类)高分辨率共焦图像显示了频率分布直方图中线周围显示α-syn强度的神经元数量（比例尺：5μm）。(F类)使用ImageJ软件对每个神经元的α-syn蛋白水平进行定量，结果表明，与α-syn+Stuffer或α-syn+PLK2-KDM相比，当α-syn与PLK2 WT共表达时，α-syn水平显著降低。(G公司)标记频率分布直方图，显示多巴胺能神经元群中α-syn信号强度的分布(**P（P）< 0.01).
图6。
图6。
PLK2 WT过度表达，而不是KDM，在体内抑制α-syn毒性并缓解偏侧帕金森病运动障碍。(A类)显微照片和(B类)注射SNc中多巴胺能神经元的体视学定量。（比例尺：1 mm。）(B类)定量分析显示，α-syn过度表达，单独或与PLK2-KDM联合使用，都会导致多巴胺能细胞显著丢失。然而，PLK2 WT过度表达可逆转α-syn毒性(**P（P）< 0.01). (C类)纹状体TH神经支配密度图示(D类)光敏定量显示，只有α-syn的过度表达，而不是PLK2-WT或KDM，会导致同侧纹状体TH纤维的丢失（*）。(**P（P）<0.01）（比例尺：1 mm。）(E类)人类α-syn过度表达后诱发偏侧帕金森病运动障碍的直方图。注射前，所有动物表现出相同的运动能力；然而，α-syn在空载体或PLK2-KDM中的过度表达导致了对侧前爪使用的显著减少，这反映在前肢不对称，而PLK2-WT的过度表达逆转了α-syn-诱导的运动损伤**P（P）< 0.01.
图7。
图7。
PLK2 WT过度表达并没有降低大鼠中脑α-syn蛋白水平。(A类)显微照片显示注射大脑中α-syn S129A和PLK2的表达。（比例尺：50µm）(B类)共染多巴胺能神经元中α-syn S129A和PLK2共定位的高放大图。（比例尺：5µm）(C类)高分辨率共焦图像显示了频率分布直方图中线周围显示α-syn S129A强度的神经元数量（比例尺：5μm）。(D类)量化每个神经元的α-syn S129A蛋白水平表明，在所有实验条件下，蛋白水平都是相似的。(E类)标记频率分布直方图，显示多巴胺能神经元群中α-syn S129A信号强度的分布。
图8。
图8。
PLK2 WT过度表达并不能挽救S129A诱导的毒性。(A类)显微照片和(B类)注射的SNc中多巴胺能神经元的立体定量。定量分析显示，α-syn在空载体或与PLK2联合表达时过度表达可导致广泛的多巴胺能损伤。（比例尺：1毫米。）(C类)纹状体TH神经支配密度图示。(D类)光学密度定量显示，α-syn与空载体或PLK2的过度表达在同侧纹状体（*）中诱导了类似且广泛的TH纤维丢失。（比例尺：1毫米。）(E类)人类α-syn与空载体或PLK2联合过度表达后诱发偏侧帕金森病运动障碍的直方图。注射后四个月，动物表现出类似的前肢不对称性，这是由多巴胺能细胞丢失引起的。
图9。
图9。
磷酸化在α-syn周转、聚集和毒性调节中的潜在作用。(A类)α-syn聚集途径的示意图。α-syn的单体形式和多体形式（二聚体、三聚体等）之间存在动态平衡。对这种平衡的放松调节会促进α-同纤维的形成，然后形成异常的蛋白质细胞质内含物，称为路易小体。(B类)图示磷酸化在调节α-syn聚集中的作用。PLK2-和CK1-介导的α-syn磷酸化分别在S129和S129+S87抑制体外和体内的α-syn聚集（25、32、52）。此外，S129（13）处的PLK和GRK以及S87和S129（52）处的CK1也可以直接磷酸化α-合成纤维。聚集的α-syn磷酸化可导致单体解离或稳定解离的单体，然后可溶性磷酸化的α-sny通过自噬或蛋白酶体降解途径降解或通过细胞质磷酸酶快速脱磷酸。(C类)表示磷酸化对神经元中α-syn聚集和毒性的影响的方案。积累的α-syn可以被内源性激酶磷酸化，特别是GRKs（21，22），诱导抑制α-syn-聚集和可溶性磷酸化单体的蛋白酶体降解（34，35）。在应激条件下（例如兴奋毒性）和内源性钙浓度升高，PLK2表达在神经元中被诱导（24、37、38）。过度表达的PLK2相互作用、磷酸化并诱导磷酸化α-syn的自噬降解。总之，这两种磷酸化介导的途径导致α-syn蛋白水平的显著降低和α-syn-聚集的抑制，从而保护神经元免受α-syn--诱导的毒性。
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中的注释

  • 在与PLK2的突触处沉默突触核蛋白。
    Looyenga BD，Brundin P。 Looyenga BD等人。 美国国家科学院院刊2013年10月8日；110(41):16293-4. doi:10.1073/pnas.1315622110。Epub 2013年9月26日。 美国国家科学院院刊，2013年。 PMID：24072649 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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