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.2013:9:655.
doi:10.1038/msb2013.12。

人类活动磷酸化网络的构建

罗伯特·H·纽曼 1, 胡建飞, 希·索尔·罗, 致谢, Crystal Woodard公司, 约翰·奈斯温格, 克里斯托弗库珀, 马修·雪莉, 希拉里·克拉克, 胡少辉, Woochang黄, Jun Seop Jeong先生, 吴刚, 吉米·林, 鑫鑫高, 强尼, 雷努·戈尔, 夏淑丽, 《鸿凯记》, 凯文·N·达尔比, 莫里斯·J·伯恩鲍姆, 菲利普·科尔, 斯特凡·纳普, 亚历克谢·龙扎诺夫, 唐纳德·扎克, 塞斯·布莱克肖, 托尼·鲍森, 安妮·克劳德银杏, 斯蒂芬·德西德里奥, 阿克希利什·潘迪, 本杰明·特克, 金章, 朱恒, 姜倩
附属公司

人类活动磷酸化网络的构建

罗伯特·H·纽曼等。 分子系统生物. 2013.

摘要

人类磷酸化网络的前景尚未得到系统的探索，它代表了细胞信号网络中广阔的、未标记的领域。虽然大量体内磷酸化残基已通过基于质谱（MS）的方法鉴定出来，但将上游激酶分配给这些残基需要对激酶-底物关系（KSR）进行生化分析。在这里，我们开发了一种新的策略，称为CEASAR，它基于功能蛋白微阵列和生物信息学，通过实验确定289种独特激酶的底物，从而产生3656个高质量的KSR。然后，我们为每种激酶生成一致的磷酸化基序，并将该信息与MS测定的体内磷酸化位点信息结合起来，构建一个高分辨率的磷酸化网络图，将230个激酶连接到652个底物中的2591个体内磷酸化位点。该数据集的价值通过发现Btk（Bruton’s酪氨酸激酶）下游PKA在B细胞受体信号传导中的新作用而得到证明。总的来说，这些研究为激酶介导的信号通路提供了全球见解，并有望促进我们对人类细胞信号过程的理解。

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数字

图1
图1
CEASAR战略示意图。原始KSR数据集（左上面板）由24 046个识别的KSR组成在体外使用纯化的人类激酶和功能蛋白微阵列。该数据集被用作使用CEASAR策略创建人类磷酸化网络高分辨率地图的起点。首先，为了识别在生理条件下可能发生的KSR，对已知KSR进行了贝叶斯网络分析，得出了一种算法，该算法为原始KSR数据集中实验得出的每个KSR分配了一个似然分数。然后，这些信息被用来构建一个精细的KSR（refKSR）数据集，该数据集由3656个可能在生理条件下发生的新KSR组成。最后，将refKSR与719个已知KSR组合，生成组合KSR（comKSR）数据集。comKSR数据集（中间，左面板）由4375个KSR组成，用于构建人类磷酸化网络，高分辨率地图建立在该网络之上。接下来，将rawKSR数据集与有关体内使用M3算法确定一致磷酸化基序的磷酸化位点（右上方）。使用这种方法，我们确定了我们收集的289种激酶中284种的共有基序（中间，右面板）。最后，关于共识网站和体内磷酸化位点与comKSR数据集集成，以生成人类磷酸化网络的高分辨率地图（底部面板）。该网络将底物上4417个磷酸位点与其同源激酶连接起来，仅包括那些可以明确指定给特定激酶的位点。磷酸塞林（pS）、磷酸苏氨酸（pT）和磷酸酪氨酸（pY）位点分别表示为红点、绿点和蓝点。
图2
图2
基于单元格的refKSR验证。(A类)第一轮基于细胞的验证实验示例。用V5标记的同源激酶或空载体共同转染FLAG标记的底物，并检测电泳迁移率和/或蛋白质水平的激酶依赖性变化。在底物中观察到三种主要的激酶依赖性变化：迁移率转移、底物耗竭（不稳定）或底物积累（稳定）。LC，加载控制。(B类,C类)第二轮基于细胞的验证研究中的两个例子。（B） 顶部面板：DDEFL1/ASAP3的PKC依赖性稳定。如（A）所述，在存在或不存在V5-PRKCB1的情况下表达FLAG-DDEFL1。底图：转染FLAG-DDEFL1的HeLa细胞在PKC抑制剂Gö6983存在或不存在的情况下，用佛波醇-12-氨基甲酸乙酯-13-醋酸盐（PMA）处理指定时间。然后对FLAG-DDEFL1进行免疫沉淀，并用磷酸化PKC底物的特异性抗体进行检测，然后剥离并用抗FLAG抗体进行再防护。每条波段的归一化强度比显示在车道下方。(C类)顶板：HLCS的PKA依赖性稳定。如（A）所述，FLAG-HLCS在存在或不存在V5-PRKACA的情况下表达。底图：转染FLAG-HLCS的HeLa细胞在PKA抑制剂H89存在或不存在的情况下用forskolin（Fsk）处理指定时间。然后对FLAG-HLCS进行免疫沉淀，并用磷酸化PKA底物特异性抗体进行检测，然后用抗FLAG抗体进行剥离和检测。每个波段的归一化强度比显示在相应的车道下方。总的来说，在测试的19个refKSR中，有15个得到了验证。
图3
图3
通过M3鉴定磷酸化基序。(A类)为了预测我们收集的激酶的一致磷酸化基序，我们首先获得了给定激酶（例如CAMK2D）底物上的所有已知磷酸化位点作为前景。同样，收集所有人类蛋白质中的磷酸化位点作为背景（步骤1）。然后将前景中的每个站点与观察到的和预期的频率矩阵进行比较，并将得分最高的站点作为种子站点包括在内（步骤2）。然后用种子序列更新前景频率矩阵，并将剩余的序列与该矩阵进行比较，以识别最匹配的序列。然后将得到的序列添加到种子序列中，并更新矩阵（步骤3）。重复整个过程，直到剩余序列的最佳得分低于临界值，或直到种子序列的数量等于磷酸化试验期间测定的激酶底物的数量（步骤4和步骤5）。最后一组位点用于推导激酶的一致序列（步骤6）。(B类)使用M3和扫描肽阵列方法生成的基序之间的比较。图中显示了通过M3（右）和肽库（左）方法识别的代表性基序。对于每个示例，使用这两种方法生成的图案之间的相似性分数，以及相应的对-值，在右侧列出。
图4
图4
人类磷酸化网络的高分辨率地图(A类)高分辨率地图，其中体内磷酸化位点被上游激酶磷酸化，并标注在代表KSR的边缘（见插图）。蓝色边缘表示本研究中获得的KSR，而灰色边缘表示根据文献整理的KSR。橙色和绿色节点分别代表激酶和非激酶蛋白。该网络的可搜索版本可以在phosphonetworks.org上找到(B类)基于细胞的磷酸化位点预测验证。突变位点用上标表示。对于每个车道，首先将信号强度（α-FLAG）归一化为加载控制（LC）的信号强度，然后与每组的“仅基板”信号进行比较。蓝色和红色条分别表示WT和突变（MT）集。误差条表示至少两个独立实验的标准误差。指出了预测的磷酸化基序（Logo）和每个底物（磷灰石）内突变位点周围的主要氨基酸序列。预测有助于激酶识别的残基被划线，突变位点以红色突出显示(C类)体外磷酸化位点预测的验证。每个无线电标记波段的信号强度如（B）所示。误差条表示至少两个独立实验的标准误差。
图5
图5
将PKA描述为Btk和ARID3A之间缺失的链接。(A类)在HeLa细胞中存在或不存在V5-PKA时，FLAG-标记ARID3A（F-ARIDAA）蛋白水平的激酶依赖性变化。LC，加载控制。(B类)内源性PKA激活对ARID3A蛋白水平的影响。(C类)在HeLa细胞中使用IP-免疫球蛋白偶联分析验证PKA-ARID3A KSR。α-pPKA-sub，一种针对磷酸化PKA底物的抗体。(D类)将S353确定为有助于PKA介导的ARID3A稳定化的磷酸化位点。(E类)验证HeLa细胞中的BTK-PKA KSR。(F类)PKA Y331作为Btk磷酸化位点的鉴定。左：由M3算法生成的Btk磷酸化基序（Logo）和PKA上Btk介导的磷酸化的预测位点。格式如图4B所示。正确的：体外使用重组Btk、WT PKA和PKA进行激酶分析Y331F年（MT）作为基质。分别使用针对pTr残基（α-pTyr）和PKA（α-PKA）的抗体来确定每个通道中的Tyr磷酸化程度和总PKA。(克)Btk介导的磷酸化对PKA活性的影响在体外重组WT-PKA首先在含有冷ATP的反应缓冲液中有（红色）或无（蓝色）Btk的情况下培养。去除Btk后，PKA与重组ARID3A在[γ-32P] -测定ATP和磷酸化ARID3A。使用突变PKA（PKAY331F年)在Btk（绿色）的见证下。n个=每种条件±s.e.m.进行2-4次试验。；双尾t吨-测试与PKA+Btk，PKA：**对=5.7 × 10−5，MT+Btk：**对=2.2×10−5(H（H）)BCR激活后Btk介导的内源性PKA磷酸化。每个值代表平均pTyr信号强度，与总PKA标准化。TA，土酸。n个=3每种条件±s.e.m。；单尾的t吨-试验与F（ab′）2单独（−/+），未经处理（−/−）：**对=0.009，F（ab′）2+TA（+/+）：**对=0.004. (我)BCR激活对PKA活性的影响。(J型)BCR激活后PKA介导的ARID3A磷酸化。根据总ARID3A标准化的平均pPKA基板信号强度显示在每条车道下方。n个=4每种条件±s.e.m。；单尾t检验与F（ab′）2单独（−/−/+），未经处理（−/−/-）：**对=0.003，F（ab′）2+H89（−/+/+）：**对=0.007，F（ab′）2+TA（+/-/+）：*对=0.019. (K（K）)PKA抑制对Ca的影响2+BCR激活后的动态。F（ab′）的代表性钙微量2-使用Indo-1成像获得在各种浓度的H89存在下刺激的Ramos B细胞。F（ab′）的加法2由箭头指示。
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