TNFα signals through specialized factories where responsive coding and miRNA genes are transcribed

doi:10.1038/emboj.2012.288

.2012年11月28日；31(23):4404-14.

doi:10.1038/emboj.2012.288。 Epub 2012年10月26日。

TNFα信号通过应答编码和miRNA基因转录的专门工厂传递

银杏¹, 塔卡希德·科赫, 萨比亚萨奇巴布, 约书亚·D·拉金, 邓彬伟（Binwei Deng）, 帕特里克·肖特, 水池筑美, 斯蒂芬-泰勒, 靖国神户, 米卡·小林, 李国良, 华美坡, 阮晓安, Hiroyuki Aburatani（阿布拉塔尼）, 家阮义军, 佐田达彦, 和田友一郎, 彼得·库克

附属公司

PMID： 23103767
PMCID公司：项目经理3512387
内政部： 10.1038/emboj.2012.288年

TNFα通过专门的工厂发出信号，在那里应答性编码和miRNA基因被转录

银杏等。欧洲工商管理硕士J. 2012.

.2012年11月28日；31(23):4404-14.

doi:10.1038/emboj.2012.288。 Epub 2012年10月26日。

作者

银杏¹, 塔卡希德·科赫, 萨比亚萨奇巴布, 约书亚·D·拉金, 邓彬伟（Binwei Deng）, 帕特里克·肖特, 水池筑美, 斯蒂芬-泰勒, 康木康纯, 米卡·小林, 李国良, 华美坡, 阮晓安, Hiroyuki Aburatani（阿布拉塔尼）, 家阮义军, 佐田达彦, 和田友一郎, 彼得·库克

附属

¹英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院。

PMID： 23103767
PMCID公司：项目经理3512387
内政部： 10.1038/emboj.2012.288年

摘要

肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种有效的细胞因子，通过核因子κB（NFκB）发出信号，激活人类基因的一个子集。通常认为，这涉及到RNA聚合酶转录反应基因，无论它们位于细胞核中的何处。利用原代人内皮细胞、染色体构象捕获变异体（包括4C和染色质相互作用分析及配对标记测序）和荧光原位杂交检测单个新生转录物，我们发现TNFα诱导反应基因在离散的“NFκB工厂”中聚集。一些工厂还专门转录编码靶向下调mRNA的micro-RNA的应答基因。我们希望所有的信号通路都包含这条额外的腿，响应基因在类似的专业工厂中转录。

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图1
假设。NFκB（绿色）通常是细胞质，基因1,三、和5在工厂（蓝色球体）转录，而TNFα应答基因2,4和6未连接且处于非活动状态。图中仅显示了与工厂相连的～16个序列中的3个序列（Cook，2010）。TNFα诱导NFκB（现在为紫色）p65亚单位的磷酸化，导入细胞核，与反应性启动子和/或工厂结合，一个相关启动子通过核质扩散，并与已成为“专业化”工厂（绿色球体）中的反应性基因的工厂转录发生碰撞。因此，基因2现在位于其他反应性NFκB结合基因附近。基因1仍然附着并转录，但稍后可能被应答基因取代6如果该模型适用，那么TNFα刺激应带来基因2接近其他反应基因。

图2
4C显示TNFα诱导*SAMD4A型*和*外景1*与其他反应基因相关。HUVECs在TNFα中生长0-60分钟（±BAY 11-7085，“BAY”-p65磷酸化的抑制剂），并应用4C。(A类)20个4C库中不断发展的联系人。指出了参考基因、BAY预处理和刺激后时间。使用准备的库的结果囊我或*Hin公司*dIII被合并。一些*Hin公司*dIII文库也通过高通量测序进行了分析（“*外景1-/SAMD4A*-seq’，结果为10–60分钟*外景1*库池并标记为“10+”）。0分钟时，大多数联系人处于“内部”状态-*SAMD4A型*/-*外景1*’. 10分钟后，与非基因和基因区域接触；到了30和60分钟，大多数都是与其他基因区。使用BAY进行预处理可以防止这种演变。(B类)大多数接触者（在10到60分钟内检测到两次独立的接触）都带有应答的p65结合基因。基因被评分为TNFα反应性（与0分钟水平相比变化1.5倍，使用公开的微阵列数据确定），并且能够结合NFκB或RNA聚合酶II的p65亚单位（红色），或非反应性/非结合性（蓝色；此处使用ChIP-seq确定）。每行给出一个基因的结果；提出了一组75个随机选择的人类基因进行比较（如补充表S1和S2所示，基因按接触人数递减的顺序列出）。总共57%的联系人(n个=21）制造商*SAMD4A型*（39%由*外景1*-seq；n个=57）具有应答性并结合p65和聚合酶的基因；随机集的值（7%；*n个=*75）明显更低(*P（P）*两种情况下均<0.0001；双尾Fisher精确检验）。

图3
携带miRNAs的TNFα应答基因共同相关。在TNFα中培养HUVEC（0-60分钟），纯化总核酸并应用3C/4C。(A类)通过qRT-PCR评估前体miRNAs水平（相对于*RNU6号机组*RNA；±标准差。；n个=3). （非反应性）miR-15α水平保持不变；其他三种miRNA在30分钟后达到峰值(B类)反应性miRNA宿主基因相互关联。3C透露*MIR17型*（在HSA 13上）触点*155英里*（21日）和*MIR191型*（3）30分钟后（但不是0分钟）；它不接触*MIR15A型*（13日）。频带反映联系人和内部控件-*GAPDH公司*显示了触点和负载。(C类)*MIR17HG型*,*155HG英里*、和*MIR191型*经常接触其他结合p65的应答基因。刺激30分钟后生成4C文库，每个序列中约96个插入。*左侧：*条形图显示了所看到的接触类型。*正确的：*至少两次就诊的生殖器接触者按就诊次数最多的顺序排列（另见补充表S3）。然后将其评分（如图2B所示）为有反应和/或能够结合NFκB和/或RNA聚合酶II的p65亚单位（红色），或无反应/无结合（蓝色）。箭头：miRNA宿主基因。观察到与miRNAs基因的高接触频率（43%；n个=42）是显著的，因为在*SAMD4A型*和*外景1*蛋白质编码基因（补充表S1和S2），因为只有1424个此类基因已知（约22000个RefSeq基因中；*P（P）*两种情况下均<0.0001；双尾Fisher精确测试）。总的来说，33%的联系人*MIR17HG型*(n个=12），50%乘以*米155汞柱*(n个=16）和36%*MIR191型*(n个=14）具有TNFα应答基因，结合p65和聚合酶的基因显著高于7%(n个=75）见图2B中的随机集(*P（P）*分别=0.019、0.0001和0.0076；双尾Fisher精确测试）。图源数据可以通过补充数据找到。

图4
RNA FISH显示了由反应基因编码的新生RNA在工厂大小的结构中的共定位。用TNFα刺激HUVEC，用RNA FISH检测固定的新生转录物，DAPI染色的细胞成像，用高分辨率定位测量重叠的红色和绿色信号之间的距离。(A类)典型图像（插图显示选定焦距的放大倍数）。酒吧：2微米。（i–iv）绿色探针靶向由*SAMD4A型*（或*EDN1型*，HSA 6上的非接触、非响应控制，其活性与*SAMD4A型*)而一组多重红色探针靶向由七个不同基因编码的内含子RNA（靶向距离*SAMD4A型*，或在不同的染色体上）。约60%*SAMD4A型*焦点（绿色）与红色焦点（可能包含1-7个目标）共定位，得到黄色焦点；显著减少*EDN1型*焦点（绿色）与红色焦点共定位(*P（P）*<0.0001; 双尾Fisher精确测试）。（v，vi）当*外景1*（HSA 8上的一个应答基因，与*SAMD4A型*; 见补充表S1和S2）或*RCOR1型*（同一染色体上的非接触、无反应控制*SAMD4A型*其活动与*GAPDH公司*)与七个多路复用器一起使用*SAMD4A型*-联系目标(*P（P）*两种情况下均<0.0001；双尾Fisher精确测试）。（vii，viii）一个红色探针靶向新生的前miR-155或前miR-15a RNA（非反应性对照），而一组多重绿色探针靶向八个不同的新生前miRNA（所有4C接触*米155汞柱*). 约25%的前miR-155病灶（红色）与绿色病灶共存；与绿色病灶共存的miR-15a前（红色）病灶显著减少(*P（P）*=0.019; 双尾Fisher精确测试）。(B类)高分辨率定位（22-nm精度）。黄色病灶，如(A类)已选定(n个给出了分析的焦点数量），并测量了红色和绿色通道中峰值之间的间隔。直方图给出了分离的频率，蓝色曲线是该直方图的伽马射线，橙色曲线是如果成对的红点和绿点随机分布在90-nm球体周围的35-nm外壳中，则预期的分布（Papantonis等人，2010）。插入：红色/绿色荧光110-nm珠子给出的峰间分离，用作共定域控制。

图5
ChIA-PET证实TNFα应答基因和编码miRNAs的基因共同相关。在TNFα中培养HUVEC 0或30分钟，免疫选择活性RNA聚合酶II，进行ChIA-PET，并分析所选基因之间的相互作用。使用双尾Fisher精确检验评估差异的统计显著性(A类,B类)或χ²耶茨修正测试(C类). (A类)大多数基因接触由*SAMD4A型*,*外景1*30分钟时，三个miRNA基因为TNFα反应性和p65结合。接触基因（每个接触者有3个或2个PET，用于*SAMD4A型*/*外景1*和miRNA基因）分别按等级顺序显示（常见的），并按图2B中的反应性/结合性（红色）或非反应性/非结合性（蓝色）评分。箭头：携带两个miRNAs的基因。总的来说，49%的联系人*SAMD4A型*(n个=68），36%*外景1*(n个=28），46%通过miRNA基因(n个=28）是TNFα反应性的，并结合p65和聚合酶——显著富集(*P（P）*分别<0.0001、0.0006和<0.0001）与随机集（7%；n个=75). 观察到的携带miRNAs的接触者的频率（14%；n个=28）显著高于*SAMD4A型*和*外景1*(3%;n个=228;*P（P）*=0.015). (B类)TNFα上调最多的69个基因的接触。彩色方框表示两个基因之间的0（蓝色）、1（黄色）或⩾2（红色）接触/PET。顶部：基因按TNFα上调的顺序排列（从左到右，从上到下；全部为1.9倍，在刺激后0分钟和60分钟用微阵列测定）。值得注意的是，30分钟后会有更多的接触(*P（P）*<0.0001).底部：相同的69个上调基因与69个高表达但无反应的基因（均为±1.5倍，如上所示）；30分钟后，接触次数明显减少(*P（P）*<0.0001），而不是上述30分钟矩阵（补充图S6中的附加控制）。(C类)编码miRNAs的基因往往在刺激前后相互接触（使用编码miRNA>700个基因的PET/接触进行评估）。交互频率（%）是PET的数量除以可能的成对组合的数量*～700 miRNA基因之间的接触显著增多(左边;*P（P）<*0.0001），与具有相同数量随机选择、高表达或诱导基因的～700 miRNA基因相比。

图6
转化生长因子β诱导应答*ETS2公司*与其他TGFβ反应基因相关。用TGFβ刺激后0或60分钟采集的HUVEC制备4C文库，使用*Hin公司*dIII和TSSETS2公司作为参考点；分别对0和60分钟文库中的95和196个插入序列进行了测序。还分离了总RNA，并评估了一些接触者编码的新生RNA水平（使用带内含子探针的qRT-PCR）。(A类)4C库。左侧：触点分类如图2A所示；最初大多数是“内部-*ETS2公司*但随后会发展出更多的基因接触。赖特：如图2B所示，至少见过两次的Genic触点（按触点数量的排列顺序列出）被评分为响应/绑定（红色）或无响应/非绑定（蓝色）。总共35%的联系人(n个=17）均对TGFβ有反应，并与SMAD相关（使用已发表的ChIP数据进行评估；Koinuma等人，2009a，2009b），显著高于3%(n个=36; 控制集中的补充表S7）(*P（P）*=0.003; 双尾Fisher精确测试），与专门的“SMAD”工厂共同转录的TGFβ应答基因一致。*灰色矩形*：一些TGFβ反应性接触者也对TNFα反应。(B类)Circos软件用于描述*ETS2公司*（在HSA 21上，箭头)随着时间的推移，联系人不断发展。内圈：从1到Y顺时针绘制的染色体象形图。外圆：两组SMAD ChIP数据（Koinuma等人，2009a，2009b）。内部：联系人*ETS2公司*（方框表示数字）60分钟后增加，主要是与SMAD结合的位点。(C类)接触的所有基因的反应*ETS2公司*刺激后（至少两次）使用qRT-PCR进行评估。显示了新生RNA表达水平的倍数变化（相对于0分钟）。总的来说，71%的接触基因上调了1.5倍（用红色虚线表示）。

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