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。2012年10月16日；109(42):16951-6.
doi:10.1073/pnas.1201408109。 Epub 2012年10月1日。

人体样本分析显示Joubert综合征/Meckel综合征患者SHH依赖性小脑发育受损

安德烈亚·阿吉拉尔 1, 艾丽斯·梅尼尔, 莱蒂娅·斯特雷尔, 杰勒娜·马丁诺维奇, 玛丽斯·邦尼尔, 塔妮娅·阿蒂·比塔赫, 弗雷赫特·恩查·拉扎维, 纳塔莉·斯帕斯基
附属公司

人体样本分析显示Joubert综合征/Meckel综合征患者SHH依赖性小脑发育受损

安德烈亚·阿吉拉尔等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

Joubert综合征（JS）和Meckel综合征（MKS）是以小脑蚓部严重缺陷为特征的多向性睫状体病，从发育不全到发育不全。有趣的是，睫状体条件突变小鼠的小脑发育不全，小脑颗粒细胞祖细胞（GCP）对声波刺猬（SHH）的反应严重减少。这表明Shh信号缺陷可能导致人类综合征中观察到的蚓部发育不全。由于现有的JS/MKS突变小鼠模型提出了明显矛盾的JS/MKS病因假设，我们直接在人类胎儿样本上研究了Shh信号。首先，在人类小脑发育的检查中，我们将GCP的增殖速率与Shh活性信号的不同水平和位置联系起来，并表明GCP具有一个以CEP290为基底的初级纤毛。其次，我们发现JS/MKS和Jeune综合征患者小脑中GCP的增殖及其对SHH的反应严重受损。最后，我们发现所有分析过的睫状体病患者小脑蚓部和大脑半球GCP增殖缺陷相似，表明正常发育不良/发育不全的特定原因先于此缺陷。我们从人体样本分析中获得的结果表明，JS/MKS影响了大脑半球和蚓部，并为这些病理过程中的细胞机制缺陷提供了证据。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
CEP290在小鼠和人类GCP的基础上富集；shRNA-介导的190年减少纤毛细胞的数量。(A类)传输21周人EGL样本的EM图像。左侧：三个GCP有一个初级纤毛（黄色箭头），从中心粒（蓝色星号）附近的BB（黑色星号）延伸。初级纤毛有一个基脚（黑色箭头）和一个睫状囊，其底部被电子致密材料（黄色箭头）覆盖。(B类)小鼠冰冻切片上CEP290（绿色）和BB小根成分根素（红色）的免疫组织荧光成像(左侧)和人类小脑(赖特). 在小鼠EGL中，CEP290小点围绕着小根；这种模式是从胚胎第16天到出生后第14天观察到的。在21周龄的人类EGL中，CEP290也定位于BB小根周围的小点中。(C类)粘附星形胶质细胞干细胞中CEP290（白色）、GFP（shRNA转染细胞，绿色）和睫状体和BB标记物聚谷氨酸化微管蛋白（GT335，红色）的免疫染色，转染GFP表达质粒驱动scramb或CEP290 shRNA的表达（绿色）。大多数对照转染细胞表达CEP290，并具有初级纤毛。当CEP290在CEP290 shRNA-表达细胞中不再被检测到时，它们不具有初级纤毛。(D类)打乱或CEP290 shRNA转染细胞中初级纤毛的定量。对于CEP290 shRNA-转染细胞，只对那些CEP290不再免疫检测的细胞进行定量。CEP290下调导致呈现纤毛的细胞减少69%。结果显示为三个重复的平均值。误差条指示SD。（比例尺：A类、从左到右、从上到下、10μm、2.5μm和0.5μm；B类，5微米；C类，从左到右，2μm和1μm）
图2。
图2。
大多数JS/MKS患者小脑蚓部和半球的GCP增殖严重受损。(A类)在gw 23 JS/MKS病例070151和gw 21对照的EGL中表达标志物Ki67（红色）的循环细胞的免疫标记。在所有面板中，一条虚线概述了EGL。请注意，JS/MKS案例的EGL中标记的单元格较少(赖特)与对照组相比(左侧)，尽管EGL的厚度在这两种情况下是可比较的。(B类)每100μm Ki67阳性细胞的定量212例JS/MKS患者的EGL（CEP290、MKS3、CC2D2A和仍在调查中的突变）、1例JATD、1例HLS和11例年龄匹配的对照。在对照组中，GCP增殖高达12 gw，在约14至15 gw时大大降低(P（P）<0.05），从第15周再次增加到第21周(P（P）<0.005），然后稳定在一个明显较高的平台。与对照组相比，大多数JS/MKS病例（10/12）和JATD病例小脑（蚓部和半球）中Ki67阳性细胞的数量显著减少。(C类)每100μm Ki67阳性细胞2对照组和JS组小脑蚓部和半球B类与所有对照病例（绿色）一样，在研究的七个JS/MKS病例（蓝色）中，有五个病例的蚓部（浅绿/蓝色）和半球（深绿色/蓝色）的增殖缺陷相似。（比例尺：10μm）***P（P）< 0.001, **P（P）<0.01，以及*P（P）<0.05。
图3。
图3。
SHH信号在EGL表面开始指数增加的对照病例中是活跃的。(A类)联合原位杂交SHH公司或GLI1型gw12、17和33的mRNA和calbindin免疫染色。在gw 12，无论是PC（箭头）还是EGL快递SHH公司而EGL表达GLI1型在17 gw时，在观察到的GCP增殖峰值附近，一些钙结合蛋白阳性PC仍向软脑膜表面迁移，表达可检测到的SHH公司信使核糖核酸（箭头），而其他则没有（箭头）。同时，GLI1型mRNA在EGL中表达。在第33周，在EGL下方排列成单细胞行的PC均表达高水平的SHH mRNA（箭头所示）。(B类)水平H&E染色切片上EGL表面的量化（绿点）。从可检测SHH表达开始（即gw 17，蓝色箭头），拟合所有数据点的指数曲线开始偏离从gw 10到gw 15的数据点计算的线性回归。差异与GCP增殖峰值的时间相对应（图2，紫色箭头），表明GCP增殖速率的SHH依赖性增加是EGL表面指数增加的原因。（比例尺：20μm）
图4。
图4。
已保存SHH公司表达和简化GLI1型大多数GCP增殖缺陷的JS/MKS患者的mRNA和PTC水平。(A类)GLI1型,PTC公司、和SHH公司与对照组相比，JS样本中的表达。通过原位杂交（SHH，GLI1）或免疫组织化学（PTC）评估SHH、GLI1和PTC的表达水平。SHH公司在绝大多数具有GCP增殖缺陷的JS/MKS病例中，mRNA表达是保守的，但GLI1型mRNA和PTC公司水平降低或检测不到，表明对SHH的反应有缺陷。（～，与WT相当；ND，未确定；NE，未表示；−，减少。）(B类)组合SHH公司JS病例080144和年龄匹配对照的原位杂交和钙结合蛋白免疫标记。SHH公司JS钙结合蛋白阳性PC（绿色）中的mRNA水平与对照水平相当。EGL和PC层（PCL）由虚线分隔。(C类)GLI1型两例JS患者和年龄匹配的对照组的原位杂交或PTC免疫组化和DAPI染色。GLI1型JS EGL中mRNA和PTC表达降低。（比例尺：20μm）
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