Protein kinase Cα phosphorylates a novel argininosuccinate synthase site at serine 328 during calcium-dependent stimulation of endothelial nitric-oxide synthase in vascular endothelial cells

doi:10.1074/jbc.M112.378794

.2012年7月27日；287(31):26168-76.

doi:10.1074/jbc。M112.378794。 Epub 2012年6月13日。

在钙依赖性刺激血管内皮细胞中内皮一氧化氮合酶期间，蛋白激酶Cα磷酸化丝氨酸328处一个新的精氨琥珀酸合成酶位点

里奇·J·海恩斯¹, 凯伦·德·科尔宾, 劳拉·彭德尔顿, 杜安·艾希勒

附属公司

PMID： 22696221
预防性维修识别码：项目经理3406701
内政部： 10.1074/jbc。M112.378794号

在钙依赖性刺激血管内皮细胞中内皮一氧化氮合酶期间，蛋白激酶Cα磷酸化丝氨酸328处一个新的精氨琥珀酸合成酶位点

里奇·J·海恩斯等。生物化学杂志. 2012.

.2012年7月27日；287(31):26168-76.

doi:10.1074/jbc。M112.378794。 Epub 2012年6月13日。

作者

里奇·J·海恩斯¹, 凯伦·德·科尔宾, 劳拉·彭德尔顿, 杜安·艾希勒

附属

¹美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学莫萨尼医学院分子医学系，邮编33612。

PMID： 22696221
预防性维修识别码：项目经理3406701
内政部： 10.1074/jbc。M112.378794号

摘要

内皮型一氧化氮合酶（eNOS）利用左旋精氨酸作为其主要底物，将其转化为左旋瓜氨酸和一氧化氮（NO）。l-瓜氨酸通过精氨琥珀酸合成酶（AS）和精氨琥酯裂解酶两种酶循环生成l-精氨酸，为内皮细胞中eNOS和NO的生成提供底物精氨酸。这三种酶eNOS、AS和精氨琥珀酸裂解酶共同构成瓜氨酸-NO循环。虽然AS可以催化NO生成的速率限制步骤，但对于AS在内皮细胞中转录水平以外的调节却知之甚少。在本研究中，我们发现，当牛主动脉内皮细胞被钙离子载体或thapsigargin刺激产生NO时，AS Ser-328磷酸化与eNOS Ser-1179磷酸化协同调节。此外，使用体外激酶分析、激酶抑制研究以及蛋白激酶Cα（PKCα）敲除实验表明，AS Ser-328的钙依赖性磷酸化是由PKCα介导的。总的来说，这些发现表明，在促进NO生成的条件下，根据eNOS的钙依赖性调节，调节Ser-328处AS的磷酸化，并与AS在血管内皮细胞瓜氨酸-NO循环中的速率限制作用相一致。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**328系列(*328件*)是一个可被激酶接触的暴露部位，显示出与治疗相关的磷酸化变化。**用AS表达载体瞬时转染BAEC，然后用10μ米缓激肽或50 n米冈田酸。AS是他的标签纯化，然后进行SDS-PAGE。在串联质谱分析之前，切除与AS对应的带并消化胰蛋白酶。结果代表一个实验，用三份样本进行分析，S.E.表示为*错误栏。NT公司*，未处理。

**图2。**
**钙诱导的NO生成依赖性刺激降低精氨琥珀酸合成酶Ser-328的磷酸化(*328件*).** 一个和C类，BAEC接受胰岛素治疗(*Ins公司*)100 n时米(一个)或100 ng/ml时的VEGF(C类)20分钟。磷酸化(*P（P）*)使用磷酸特异性抗体通过蛋白质印迹进行测定，并用eNOS和AS特异性抗体重新处理。印迹是三个独立实验的代表。*NT公司*，未处理。B类和D类，密度值分别表示从非处理对照组归一化为总eNOS或AS的变化百分比。密度变化显著，S.E.表示为*误差线*(n个= 3,第页< 0.05).E类，从用胰岛素或血管内皮生长因子处理过的BAEC培养基中提取的亚硝酸盐，采用DAN分析法，以S.E.表示*误差线*(*,n个= 3,第页< 0.05).

**图3。**
**与WT或类磷酸化物（S328D）相比，过度表达的Ser-328磷酸化突变为丙氨酸产生的受刺激NO显著减少。** 一个BAEC瞬时转染WT，将磷酸-全丝氨酸转染至丙氨酸328（S328A），或将磷酸-氨基酸丝氨酸转导至天冬氨酸（S328D）AS，然后用0.5μ米钙离子载体A23187和50μ米原钒酸钠。结果代表了S.E.的四个不同实验*误差线*. (*,第页<0.05相对于WT；†，第页<0.05（相对于S328D）。B类，代表性Western blot证实WT、S328A和S328D过度表达。

**图4。**
**钙依赖性刺激NO生成增加精氨酸琥珀酸合成酶Ser-328的磷酸化。** 一个磷酸化变化的Western blot分析(*P（P）*)相对于用钙离子载体（A23187）和thapsigargin治疗20分钟(十)在存在或不存在细胞内钙螯合剂BAPTA-AM的情况下。斑点是五个独立实验的代表。B类，密度值表示未经处理的(*NT公司*)对照分别归一化为总eNOS或AS。密度变化显著，S.E.表示为*错误栏。C类*在BAPTA-AM存在或不存在的情况下，用钙离子载体（A23187）和thapsigargin处理BAEC的培养基，用DAN分析法检测亚硝酸盐。(n个=5，较未处理显著增加：*，第页<0.05，与A23187单独使用相比显著降低，第页<0.05，与单独使用thapsigargin相比显著降低；†，第页< 0.05).

**图5。**
**42μl非等型特异性PKC抑制米罗特林或2.5μ米双吲哚甲酰胺I降低磷酸化(*P（P）*)参见AS Ser-328。**BAEC用42μ米鹿特林(*Rott公司*)或2.5μ米双吲哚甲酰亚胺I(比斯)在用钙离子载体（A23187）刺激前30分钟，持续20分钟。一个三个实验的代表性Western blot。B类，密度值表示未经处理的(*NT公司*)对照分别归一化为总eNOS或AS。密度变化显著，S.E.表示为*误差线*(n个= 3,第页< 0.05).C类用DAN法检测处理后BAEC培养基中的亚硝酸盐。A23187在添加或不添加双吲哚甲酰胺I的情况下显著增加NO的生成（相对于未处理组的显著性：*，n个= 3,第页< 0.05; 相对于A23187的显著性：，n个= 3,第页< 0.05).

**图6。**
**PKCα的敲除降低了磷酸化(*P（P）*)位于Ser-328，而不是eNOS Ser-1179。**BAEC用1或5 n米DsiRNA针对PKCα的第五外显子，并允许表达24小时，然后用钙离子载体A23187刺激20分钟，并与未处理的BAEC进行比较。一个三个实验的代表性Western blot。B类，密度值表示未经处理的(*NT公司*)对照分别归一化为总eNOS或AS。密度变化显著（除了A2317对PKCα表达或1 n米用S.E.表示的pS1179 eNOS上的DsiRNA处理*误差线*(n个= 3,第页<0.05）（相对于未处理或仅DsiRNA的显著性：*，n个= 3,第页< 0.05).

**图7。**
**PKCα，但不是Akt，磷酸化AS在体外.** 一个,*在体外*激酶分析。*灰色条*代表纯化的AS负激酶的培养(空白).黑色条表示纯化AS与指示激酶的孵育(激酶). 激酶活性用cpm表示*误差线*代表S.E(n个= 3, *,第页< 0.05).B类，代表性放射自显影*在体外*用SDS-PAGE分离的激酶反应如一个.

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