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.2011年11月11日；286（45）：39450-6。
doi:10.1074/jbc。M111.265330。 Epub 2011年9月28日。

间充质干细胞中糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的机械调节依赖于Akt蛋白丝氨酸473通过mTORC2蛋白的磷酸化

Natasha案件 1, 雅各布·托马斯, 布埃尔·森, 玛娅·斯特纳, 谢志辉, Kornelia Galior公司, 珍妮特·鲁宾
附属公司

间充质干细胞中糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的机械调节依赖于Akt蛋白丝氨酸473通过mTORC2蛋白的磷酸化

Natasha案件等。 生物化学杂志. .

摘要

机械信号可以使糖原合成酶激酶3β（GSK3β）失活，从而稳定β-连环蛋白。这种信号级联对于抑制由每日应变方案产生的间充质干细胞（MSC）的脂肪生成是必要的。我们研究了Akt是否是负责MSC中GSK3β磷酸化和失活的机械活化激酶。机械应变（2%量级，0.17 Hz）诱导Akt在Ser-473和Thr-308的磷酸化，同时GSK3β在Ser-9的磷酸化。抑制Akt（Akt1/2激酶抑制剂治疗或Akt敲除）可阻止菌株诱导的Ser-9处GSK3β磷酸化。抑制PI3K可阻止Thr-308磷酸化，但可测量到菌株诱导的Ser-473磷酸化和诱导的GSK3β磷酸化，这表明Ser-473的磷酸化足以用于下游机制反应。由于已知Rictor/mTORC2（雷帕霉素复合物2的哺乳动物靶标）通过胰岛素转导Akt在Ser-473的磷酸化，我们研究了它是否有助于菌株诱导的Ser-473磷酸化。mTOR抑制剂KU0063794阻止了机械和胰岛素治疗MSC中Ser-473的磷酸化。当mTORC2被阻断时，GSK3β的机械失活被阻止，而在没有Ser-473磷酸化的情况下，仍然可以检测到GSK3？的胰岛素抑制，这可能是通过Thr-308处Akt的磷酸化实现的。总之，机械输入启动了一个信号级联，它独特地依赖于mTORC2激活和Ser-473处Akt的磷酸化，这种效应足以导致GSK3β失活。因此，Akt下游GSK3β的机械调节依赖于Akt在Ser-473的磷酸化，其方式不同于生长因子的磷酸化。因此，Akt揭示其自身是一种多效性信号分子，其下游靶点根据激活输入的性质进行差异调节。

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数字

图1。
图1。
机械菌株诱导Akt快速磷酸化。 A类将mdMSC接种0.5–2 h，并对细胞蛋白进行磷酸化Akt和GSK3β的免疫印迹。B类、标准化为总Akt的磷酸化Akt（Ser-473）和标准化为GSK3β的磷酸化GSK3？（Ser-9）的密度分析(n个=六个实验(第页< 0.001).C类用胰岛素（100 n）处理的培养物的免疫印迹米)持续0.5–2小时。
图2。
图2。
GSK3β的机械抑制依赖于Akt激活。 A类用Akt抑制剂Akti-1/2（40μ米).B类、磷酸化GSK3β（Ser-9）归一化为GSK3总β的密度分析(n个=四个实验）。*，与无张力控制的显著差异(第页< 0.05).C类，转染无义siRNA的mdMSC总细胞蛋白的免疫印迹(硅可控硅)或siRNA靶向Akt(锡亚克特)然后培养3天，然后应用菌株45min。D类、磷酸化GSK3β（Ser-9）归一化为GSK3总β的密度分析(n个=三个实验）。*，与无张力控制的显著差异(第页< 0.01).
图3。
图3。
GSK3β的菌株依赖性磷酸化不需要PI3K。 A类用PI3K抑制剂LY294002（50μ米).B类用LY294002处理的培养物的免疫印迹，然后用胰岛素刺激（50 n米)30或60分钟。
图4。
图4。
ILK不促进Akt的机械活化。 A类，转染无义siRNA的mdMSC细胞蛋白的免疫印迹(硅可控硅)或siRNA靶向ILK(siILK公司)然后培养3天，然后应用菌株30或60分钟。B类、标准化为总Akt的磷酸化Akt（Ser-473）和标准化为GSK3β的磷酸化GSK3？（Ser-9）的密度分析(n个=三个实验(第页< 0.05).
图5。
图5。
PKC介导Ser-473的Akt磷酸化。 A类用PKC抑制剂钙蛋白C（1μ米).B类、磷酸化GSK3β（Ser-9）归一化为GSK3总β的密度分析(n个=三个实验）。*，与无张力控制的显著差异(第页< 0.01).C类在用传统PKC抑制剂Gö6976治疗后，培养物的免疫印迹受到应变30分钟。
图6。
图6。
Akt的机械激活需要mTORC2。 A类用mTOR抑制剂KU0063794（2μ米).B类、磷酸化GSK3β（Ser-9）归一化为GSK3总β的密度分析(n个=三个实验）。*，与无张力控制的显著差异(第页< 0.05).C类用雷帕霉素（30 n）处理培养物45 min后的免疫印迹米)抑制mTORC1。D类用KU0063794处理的mdMSC的免疫印迹，然后用胰岛素刺激（50 n米)持续60分钟。E类用雷帕霉素处理培养物的免疫印迹，然后用胰岛素刺激60分钟。
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