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.2011年9月2日；286(35):30352-30360.
doi:10.1074/jbc。M111.269464。 Epub 2011年7月13日。

胆管细胞N-Ras蛋白介导脂多糖诱导的白细胞介素6分泌和增殖

史蒂文·奥哈拉 1, 帕特里克·L·斯普林特 2, 克里斯蒂·特鲁索尼 2, 加布里埃拉·加伊多斯 2, Pooja N Lineswala村 三, 尼古拉斯·F·拉鲁索 2
附属机构

胆管细胞N-Ras蛋白介导脂多糖诱导的白细胞介素6分泌和增殖

史蒂文·奥哈拉等。 生物化学杂志. .

摘要

肝内胆管上皮细胞定期暴露于潜在的有害微生物和/或微生物产物中。因此，胆管细胞积极参与微生物相关的肝脏炎症反应。我们之前的研究表明，用原生动物寄生虫隐孢子虫感染培养的人类胆管细胞，或用革兰氏阴性细菌衍生的LPS治疗，都会以髓样分化88（MyD88）依赖性的方式激活NFκB。在这里，我们描述了由Toll样受体（TLR）启动的一种新的信号通路，涉及小GTPase，Ras，它介导胆管细胞促炎细胞因子的产生和胆管细胞增殖的诱导。使用培养的人胆管细胞和Ras活化试验，我们发现质膜TLR激动剂（TLR1、2、4、5和6）快速（<10分钟）激活N-Ras，但不激活其他p21-Ras亚型，导致下游Ras效应器ERK1/2快速（<15分钟）磷酸化。RNA干扰诱导的TRAF6（MyD88的下游效应器和已知的MAPK信号激活剂）耗竭对N-Ras的激活没有影响。N-Ras激活后，促炎细胞因子IL6迅速分泌。利用荧光素酶报告子，我们证明了LPS治疗诱导IL6启动子驱动的荧光素酶，该酶被MEK/ERK药物抑制剂（PD98059或U0126）抑制，并且RNAi诱导的N-Ras耗竭。最后，我们发现LPS增加了胆管细胞的增殖（1.5倍），而N-Ras的缺乏会抑制其增殖；TLR激动剂诱导的增殖在用IL6受体阻断抗体预处理后也受到抑制。总之，我们的结果支持了一个新的信号轴，该轴涉及可能参与胆管细胞致病性促炎反应的N-Ras的微生物激活。

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数字

图1。
图1。
N-Ras是培养胆管细胞中表达的主要p21-Ras亚型。 A类，从融合的H69细胞中提取RNA，并使用p21-Ras同种型特异性PCR引物进行定量RT-PCR。N-Ras mRNA的表达水平分别是K-Ras和H-Ras的2倍和5倍(第页< 0.05). 数据被归一化为18 S rRNA水平，并表示为RAS mRNA/10的拷贝618个S rRNA的拷贝。B类，LPS以剂量依赖的方式激活N-Ras。将汇合的H69细胞在LPS（0、10、50、100或200 ng/ml）存在下孵育15分钟。使用RAF-RBD-琼脂糖珠去除活化的RAS，并对N-RAS、K-RAS和H-RAS进行免疫印迹。在低至50 ng/ml的剂量下检测到活化的N-Ras，而在LPS治疗后未检测到活化K-Ras和H-Ras。总RBD-GST用作负荷控制。C类，LPS诱导的N-Ras活化迅速且持续。在LPS治疗后10分钟内检测到活化的N-Ras，并在LPS处理后60分钟内保持活化。总RBD-GST用作负荷控制。D类，用RT-PCR定量LPS治疗后胆管细胞中N-Ras的表达，并将其归一化为10618S rRNA的拷贝数。LPS处理后，N-Ras mRNA表达没有显著增加。定量PCR数据表示为平均值±标准偏差(误差线)来自三个独立实验；*，第页与N-Ras相比<0.05。
图2。
图2。
TLR激动剂诱导NFκB报告荧光素酶和N-Ras活化。 A类，将串联NFκB共有位点克隆到荧光素酶表达质粒pGL4.22中。该质粒与转染控制质粒TK共同转染到胆管细胞-雷尼利亚使用膜结合TLR激动剂Pam3CSK4（TLR1/2）、HKLM（TLR2）、LPS（TLR4）、鞭毛蛋白（TLR5）和FSL-1（TLR2/6）诱导NFκB驱动荧光素酶表达。表达为-折叠变化NFκB驱动的萤火虫荧光素酶：雷尼利亚荧光素酶与空的pGL4.22载体萤火虫荧光素酶的比较：雷尼利亚荧光素酶。数据表示为平均值±S.E(误差线).B类，对TLR激动剂处理的培养胆管细胞进行N-Ras活化分析。同样，膜结合TLR激动剂Pam3CSK4、HKLM、LPS、鞭毛蛋白和FSL-1表现出强大的N-Ras激活，而细胞质TLR激动药表现出最小的N-Ras激活。RBD-GST总量用作正常对照。C类，采用相关系数评估TLR激动剂诱导的NFκB驱动荧光素酶活性与N-Ras激活之间的线性关系。相关性很强，相关系数=0.87(年= 195.5x个−21.206；R（右）2= 0.7577).
图3。
图3。
N-Ras的激活依赖于TLR4，但不依赖于TRAF6。 A类，H69细胞转染TLR4-siRNA（50 n米)，已加扰(紧急停堆)-siRNA（50 n米)或仅FuGENE HD（对照，Ctrl键)治疗前24小时。用LPS（200 ng/ml）处理细胞15分钟，并进行RAS激活试验。Ponceau红染色用于检测RBD-GST，以确认等负荷。LPS处理后观察到N-Ras活化；然而，TLR4-siRNA与LPS处理的对照组和用打乱对照转染的LPS处理细胞相比降低了N-Ras的激活(Scr siRNA).B类LPS处理15分钟后，H69细胞中检测到磷酸化ERK增加。然而，用N-Ras siRNA转染H69细胞，有效地耗尽了N-Ras，阻断了LPS诱导的ERK磷酸化。C类使用三种不同的TRAF-6 shRNA构建物（#77、78和80）或pGIPZ空载体对H69细胞进行稳定转染。稳定克隆选择后，对TRAF6进行免疫印迹。在pGIPZ转染的细胞中检测到60-kDa TRAF6蛋白，但在表达shRNA的细胞系中TRAF6显著减少。D类NFκB荧光素酶报告系统用于确认表达shRNA#80的细胞中TRAF6的功能缺失。用pGIPZ空载体稳定转染胆管细胞(黑色条)或TRAF6-shRNA(灰色条)用LPS（200 ng/ml）或HKLM（1×108细胞/ml），然后进行双荧光素酶报告物分析。LPS和HKLM在pGIPZ转染细胞（*，第页与未经处理的对照细胞相比<0.05），而TRAF6-shRNA-表达细胞的NFκB驱动的荧光素酶活性没有增加。数据表示为平均值±S.E(误差线).E类在LPS处理的TRAF6缺失细胞上也进行了N-Ras活化分析。用LPS或HKLM处理pGIPz对照转染或TRAF6缺失的细胞15分钟。在那些TRAF6耗尽的细胞中，N-Ras活化没有减弱。膜用蓬松红染色，以确认负载相等。电动汽车，空向量。F类TRAF6的缺失对LPS诱导的ERK磷酸化没有影响。LPS（200 ng/ml，持续15分钟）处理pGIPZ空载体控制细胞和TRAF6缺失细胞均导致ERK1/2磷酸化的类似增加，如Western blotting所示。
图4。
图4。
LPS以N-Ras依赖的方式诱导IL6的表达。 A类，H69细胞转染(紧急停堆)或N-Ras siRNA在有或无LPS（200 ng/ml）的条件下培养6 h，并进行IL6免疫印迹。在用扰乱的siRNA转染的细胞中诱导IL6的表达；然而，在这个时间点，缺乏N-Ras的细胞IL6表达没有增加。肌动蛋白作为一种负荷控制物被印迹。B类用LPS（200 ng/ml）处理胆管细胞15 min，清洗并培养6 h。在组织培养上清上执行IL6 ELISA，在细胞裂解物上执行N-Ras活化分析(n个= 3). N-Ras活化对LPS处理表现出双相反应。N-Ras的激活在LPS暴露后立即发生（15分钟），在1小时时减少，3小时后再次增加。相反，在LPS治疗后1小时首次检测到IL6分泌增加，并且从LPS治疗3小时后持续升高。C类，每个时间点的细胞裂解液用于N-Ras活化分析和磷酸化ERK1/2、总ERK1/2（负荷控制）和磷酸化STAT3的免疫印迹。在15分钟时观察到N-Ras活化，并与ERK1/2的磷酸化相关。相反，在LPS治疗后，STAT3磷酸化延迟（1小时）并持续升高6小时。D类，一种IL6受体抑制抗体(IL6R抗体)减少6-h时间点的N-Ras活化。细胞在有无IL6抑制抗体和有无LPS的情况下培养。IL6抑制抗体在LPS治疗15分钟后没有抑制N-Ras的激活，但在6小时时降低了N-Ras激活。
图5。
图5。
LPS以N-Ras和ERK依赖的方式诱导IL6启动子驱动的荧光素酶报告子。 A类，H69细胞转染N-Ras WT，N-Ras G12D组分活性(C类/A类)用LPS（200 ng/ml）处理N-Ras siRNA或N-Ras S17N显性阴性质粒，并进行双荧光素酶分析。在没有LPS的情况下，N-Ras G12D组成活性突变体是唯一构建的IL6报告荧光素酶显著增加的突变体（*，第页< 0.05). LPS刺激后，N-Ras WT和构成活性突变体(G12D C系列/A类)与LPS处理的对照细胞相比，IL6报告荧光素酶显著增加。相反，N-Ras siRNA和显性阴性突变体（S17ND类/N个)与对照LPS处理细胞相比，IL6报告荧光素酶显著降低。B类在存在和不存在MEK/ERK抑制剂PD98059和U0126的情况下进行IL6启动子驱动的荧光素酶报告子分析。与在没有抑制剂的情况下培养的胆管细胞相比，这两种抑制剂都显著降低了依赖LPS的IL6启动子驱动的荧光素酶活性（*，第页< 0.05). 在IL6启动子驱动的萤火虫荧光素酶中表达为-倍变化：雷尼利亚荧光素酶与空的pGL4.22载体萤火虫荧光素酶的比较：雷尼利亚荧光素酶。数据表示为平均值±S.E(误差线;n个= 5).
图6。
图6。
N-Ras通过IL6调节LPS诱导的胆管细胞增殖。 A类，胆管细胞转染N-Ras siRNA（50 N米)使用CellTiter 96水溶液细胞增殖试验评估细胞增殖。用LPS（200ng/ml）处理的细胞表现出显著的（*，第页与未感染细胞相比，LPS治疗24小时后增殖增加。然而，使用N-Ras siRNA去除N-Ras显著降低了LPS诱导的胆管细胞增殖（#，第页<0.05）与不含N-Ras siRNA的LPS处理细胞相比。B类为了从功能上验证IL6自分泌信号在LPS诱导的增殖中的重要性，在没有或存在IL6R阻断抗体或对照、非特异性同种匹配对照抗体的情况下，用LPS或IL6处理细胞。治疗24小时后进行增殖试验。在没有IL6R阻断抗体的情况下，LPS和IL6显著增加胆管细胞增殖（*，第页<0.05）。相反，当用IL6阻断抗体预处理细胞时，LPS或IL6处理后的增殖率显著降低（*，第页<0.05）与在对照抗体存在下培养的处理细胞相比。
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