Mechanistic insights into an engineered riboswitch: a switching element which confers riboswitch activity

doi:10.1093/nar/gkq946

.2011年4月；39(8):3363-72.

doi:10.1093/nar/gkq946。 Epub 2010年12月11日。

对工程核糖开关的机械洞察：一种赋予核糖开关活性的开关元件

朱莉娅·魏甘德¹, 新浪R Schmidtke, 特里斯坦·J·威尔, 埃尔克·杜查德·费尔纳, 克里斯蒂安·哈曼, 延斯·沃纳特, 贝娅特丽克丝·苏斯

附属公司

PMID： 21149263
预防性维修识别码：项目经理3082870
内政部： 10.1093/nar/gkq946

对工程核糖开关的机械洞察：一种赋予核糖开关活性的开关元件

朱莉娅·魏甘德等。核酸研究. 2011年4月.

.2011年4月；39(8):3363-72.

doi:10.1093/nar/gkq946。 Epub 2010年12月11日。

作者

朱莉娅·魏甘德¹, 新浪R Schmidtke, 特里斯坦·J·威尔, 埃尔克·杜查德·费尔纳, 克里斯蒂安·哈曼, 延斯·沃纳特, 贝娅特丽克丝·苏斯

附属

¹RNA生物化学，约翰·沃尔夫冈·歌德（Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt，Max-von-Laue-Str.9，D-60438 Frankfurt/M，Germany）。

PMID： 21149263
预防性维修识别码：项目经理3082870
内政部： 10.1093/nar/gkq946

摘要

虽然已经鉴定出许多不同的RNA适配体与过多的小分子结合，但只有极少数能够充当工程核糖开关。即使是与同一配体结合的适配体，其调节潜力也存在很大差异。我们通过使用一组不相关的新肌球蛋白结合适配体来解决这些差异的分子基础。紫外熔融分析表明，调控适配体在配体结合时的热稳定程度显著高于非活性适配体。调节适配体在低纳米摩尔范围内表现出较高的配体结合亲和力，这对于调节来说是必要的，但还不够。核磁共振数据表明，在配体结合时，不稳定的开放基态伴随着广泛的结构变化对调节很重要。相反，在没有配体的情况下，已经预先形成了非活性适配体。通过遗传、生物化学和结构分析的结合，我们确定了一个开关元件，该元件负责在不影响结合形式的情况下破坏无配体状态。我们的结果首次解释了工程核糖开关的分子机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
新霉素结合适配体的条件控制。(A类)适配体介导的翻译起始抑制方案。适配体直接插入起始密码子的上游。左图：如果没有配体，适配体不会干扰核糖体扫描。右图：适配体-配体复合物抑制小核糖体亚单位并导致基因表达降低。(B类)核糖体A位点和新粘蛋白结合适配体N1和R23的二级结构。这些线将适配体分割成末端环、内部不对称环和闭合茎。A位点和N1之间的保守核苷酸以灰色阴影显示。(C类)杂交适配体。(D类)*绿色荧光粉*在没有（黑条）和存在（白条）100µM新霉素的情况下表达。表达载体pWHE601（6）的荧光发射*绿色荧光粉*在其5′UTR中没有适体的情况下设定为100%。没有的矢量的背景级别*绿色荧光粉*从所有数据中减去表达。价值观代表三种独立成长的文化的平均值。至少重复测量两次。

**图2。**
内环的饱和突变。(A类)N1的二级结构。GUC图案采用灰色阴影。对内环下部（装箱）进行分析和随机分组。核苷酸用N（任何核苷酸）或Y（嘧啶）表示。(**B–D类**)*绿色荧光粉*在没有（黑条）和存在（白条）100µM新霉素的情况下表达。表达载体pWHE601（6）的荧光发射*绿色荧光粉*其5′UTR中不含适配体的情况设置为100%。没有的矢量的背景级别*绿色荧光粉*从所有数据中减去表达。价值观代表三种独立成长的文化的平均值。至少重复测量两次。(E类)回路尺寸和调节之间的连接示意图。

**图3。**
熔点分析和平衡离解常数的测定(*K（K）*_D类)由ITC提供。(A类)对于1µM N1，在没有10µM新霉素（黑色曲线）和存在（红色曲线）的情况下的熔化曲线。熔化曲线记录为三份。(B类)上面板：在多次注射配体（38µM新霉素）（10µl）直至达到饱和（基线校正）期间，保持RNA溶液（4µM）温度（37°C）所需的功率。下面板：根据配体与RNA的摩尔比绘制每摩尔注射剂的综合相互作用热，并拟合到单结合位点模型。(C类)吉布斯自由能（Δ*G公司*)，焓（Δ*H（H）*)和熵（–TΔ*S公司*)N1、R23和N1（R23）的贡献。

**图4。**
N1和N1的构象和新霉素结合（R23）。(A类和B类)基于可观察到的亚氨基质子信号的数量和NOE模式，提出了自由形式N1和N1（R23）的二级结构。N1（R23）终端回路中的附加碱基对以红色突出显示(C类和D类)一维亚氨基质子区的比较-¹自由N1和自由N1（R23）的H光谱。指示信号分配。将～10.7 ppm的信号分配给G13亚氨基质子（标记为红色）的依据是与原始R23适配体在无配体状态下的光谱进行比较（20）。(E类和F类)一维Imino质子区-¹在一当量新霉素存在下N1和N1（R23）的H光谱。与（D和E）中显示的游离N1和N1（R23）的光谱相比，由于在NMR时间尺度上缓慢交换形成稳定的1:1新霉素RNA-复合物，观察到了预期的新信号和化学位移变化。

**图5。**
根据NMR数据推导出的新霉素结合后N1、N1（R23）和R23的拟议二级结构变化模型。非结构化元素以红色着色，结构化元素以蓝色着色。

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