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.2010年9月；17(9):1051-7.
doi:10.1038/nsmb.1868。 Epub 2010年8月8日。

重叠的激酶和磷酸酶对接位点调节视网膜母细胞瘤蛋白的活性

亚历山大·赫希 1, 马修·塞奇尼, 瑞秋·C·斯坦哈特, 迈克尔·沙伯, 弗雷德里克·迪克, 赛斯·M·鲁宾
附属公司

重叠的激酶和磷酸酶对接位点调节视网膜母细胞瘤蛋白的活性

亚历山大·赫斯基等人。 自然结构分子生物学. 2010年9月.

摘要

视网膜母细胞瘤抑癌蛋白（Rb）的磷酸化状态和相应的活性受到激酶和磷酸酶活性平衡的调节。在这里，我们描述了Rb与蛋白磷酸酶1（PP1c）催化亚单位的关联。晶体结构鉴定了Rb C-末端结构域中的酶对接位点，该位点是PP1c对Rb的有效活性所需的。磷酸酶对接位点与已知的细胞周期依赖性激酶（Cdk）对接位点重叠，PP1与Cdk-cyclins竞争Rb结合足以保持Rb活性并阻止细胞周期进展。这些结果为Rb活化提供了首次详细的分子见解，并建立了一种新的Rb调节机制，其中激酶和磷酸酶竞争底物对接。

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数字

图1
图1
卢比880–892对于RbC-PP1c缔合是必要的和充分的。(一)Rb的结构域与保守的Cdk共识磷酸化位点的位置。(b条)铷滴定的等温滴定量热法（ITC）数据55–928到PP1c中。(c（c）)ITC实验结果如（a）所示，但RbC截断突变体。每个实验的ITC数据示例如补充图2所示。
图2
图2
RbC的结构870–882-PP1c复合物。(一)RbC（棕色）以延伸构象结合并延伸PP1cβ-三明治结构域（青色）的表1。Mn公司2+远处PP1c催化位点的离子显示为紫色球体。(b条)Rb特写870–882-PP1c接口。显示了RbC肽（浅棕色）和PP1c（青色）之间的主链氢键相互作用。(c（c）)Rb之间的疏水侧链相互作用870–882和PP1c。
图3
图3
PP1c高效脱磷需要RbC-KLRF对接序列。(一)在磷酸酶测定中用作底物的RbC构建体。(b条)使用5μM的PP1c磷酸酶测定32P标记的phosRbC771–928和phosRbC771–874和10 nM PP1c。在指定的时间点从反应中取出的淬火小份，用磷光成像进行可视化。(c（c）)（b）中带强度随反应时间变化的曲线图。(天)光气RbC脱磷的初始反应速率与底物浓度的函数关系图771–928和phosRbC771–874将数据拟合到一个简单的稳态模型，表明类似的表观k猫值，但表观KM（M）对于phosRbC771–874明显更大。(e（电子）)（b）和（c）中所述磷酸酶分析中对接位点突变的分析。phosRbC771–928用所示突变作为底物，浓度为1μM，PP1c为10 nM。(（f）)Cdk激酶分析中对接位点突变的分析。指示RbC的2μM771–928在E2F1-DP1存在下用Cdk2-CycA磷酸化底物。
图4
图4
PP1c抑制Cdk2-CycA对RbC的活性。2μM RbC的磷酸化771–928或RbC771–874在PP1c-微囊藻毒素（15μM）饱和浓度的情况下，使用75 nM Cdk2-CycA。
图5
图5
PP1c独立于磷酸酶活性抑制Rb的Cdk失活。(一)用与所示蛋白对应的表达质粒转染Saos-2细胞。PP1的H248K形式是一种催化失活突变。G1中的细胞百分比显示为每个细胞。误差线表示至少四个实验的平均值的一个标准偏差。(b条)再次用Cdk2-CycA转染Saos-2细胞，用流式细胞仪分析Rb表达质粒和细胞周期位置。对PP1和H248K突变体的表达质粒水平进行滴定，以比较它们对Rb依赖性停搏的相对影响。(c（c）)用与所示蛋白对应的表达质粒转染C33A细胞。通过蛋白质印迹法检测Rb和磷酸丝氨酸807/811 Rb。高磷酸化和低磷酸化铷的相对迁移位置分别表示为phosRb和Rb。(天)用所示蛋白转染C33A细胞，Rb检测如（c）所示。(e（电子）)用与所示蛋白对应的表达质粒转染Saos-2细胞，并按照（a）进行分析。(（f）)用Rb或指示的Rb突变体和Cdk2-CycA表达质粒转染Saos-2细胞，如（b）所示。不断增加的PP1c被联合转染，以评估Rb突变体对磷酸化保护的敏感性，以及随后的细胞周期进展出G1期。
图6
图6
PP1c依赖性生长停滞期间丰富的Rb-PP1c复合物。(一)如图5a所示转染Saos-2细胞，以在G1早期产生PP1c依赖性阻滞。CV-1细胞从S期阻滞中释放出来，16小时后通过有丝分裂振荡分离出有丝分裂细胞。通过SDS-PAGE和western blotting分析提取物，以定量Rb和PP1c水平。Rb和PP1c的数量通过与使用重组蛋白生成的标准曲线相关的带强度来确定。数量列于各凝胶通道下方。(b条)从（a）中制备的提取物中免疫沉淀Rb，如上所述测定Rb和相关PP1c的数量。
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