Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP

doi:10.1016/j.cell.2010.03.009

.2010年4月2日；141(1):129-41.

doi:10.1016/j.cell.2010.03.009。

用PAR-CLIP对RNA结合蛋白和microRNA靶位点的转录组全鉴定

马库斯·哈夫纳¹, 马库斯·兰特勒, 卢卡斯汉堡, Mohsen Khorshid公司, 让·豪瑟, 菲利普·贝宁格, 安德烈亚·罗斯巴勒, 小曼纽尔·阿斯卡诺, 安娜·卡琳娜·荣坎普, 马蒂亚斯·蒙绍尔, 亚历山大·乌尔里奇, 格雷格·S·沃德尔, 斯科特·德威尔, 米哈拉·扎沃兰, 汤玛士·涂许尔

附属公司

PMID： 20371350
PMCID公司：项目经理2861495
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2010.03.009

用PAR-CLIP对RNA结合蛋白和microRNA靶位点的转录组全鉴定

马库斯·哈夫纳等。单元格. 2010.

.2010年4月2日；141(1):129-41.

doi:10.1016/j.cell.2010.03.009。

作者

马库斯·哈夫纳¹, 马库斯·兰特勒, 卢卡斯汉堡, Mohsen Khorshid公司, 让·豪瑟, 菲利普·贝宁格, 安德烈亚·罗斯巴勒, 小曼纽尔·阿斯卡诺, 安娜·卡琳娜·荣坎普, 马蒂亚斯·蒙绍尔, 亚历山大·乌尔里希, 格雷格·S·沃德尔, 斯科特·杜威尔, 米哈拉·扎沃兰, 汤玛士·涂许尔

附属

¹霍华德·休斯医学院，RNA分子生物学实验室，洛克菲勒大学，1230 York Avenue，Box 186，New York，NY 10065，USA。

PMID： 20371350
PMCID公司：项目经理2861495
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2010.03.009

摘要

RNA转录物受到转录后基因调控，涉及数百种以细胞类型依赖方式表达的RNA-结合蛋白（RBP）和微RNA-含核糖核蛋白复合物（miRNP）。我们开发了一种基于细胞的交联方法，用于在高分辨率和转录组范围内测定细胞RBP和miRNP的结合位点。在由4-硫代尿苷处理细胞的免疫纯化RNP制备的cDNA中，通过胸苷到胞苷的转换可以发现交联位点。我们确定了一些深入研究的RBP和miRNP的结合位点和调控结果，包括PUM2、QKI、IGF2BP1-3、AGO/EIF2C1-4和TNRC6A-C。我们的研究表明，这些因子结合了数千个包含明确序列基序的位点，并且对外显子与内含子或编码与非翻译转录区有不同的偏好。转录组中结合位点的精确定位对于解释个体间快速出现的遗传变异数据以及这些变异如何导致复杂遗传病至关重要。

PubMed免责声明

数字

**图1。PAR-CLIP方法**
（A）拆分5′的SDS-凝胶的光活化核苷（B）荧光图像的结构-³²P-标记RNA–FLAG/HA-IGF2BP1免疫沉淀物（IP）由细胞裂解物制备，细胞裂解物在不存在或存在100μM光活化核苷的培养基中培养，并与UV 365 nm交联。为了进行比较，包括从与UV 254 nm交联的细胞制备的样品。下图显示用抗HA抗体探测的免疫印迹。（C） PAR-CLIP图解。4SU标记的转录物与RBP交联，并对部分RNase消化的RNA-蛋白复合物进行免疫纯化和大小分馏。RNA分子被回收并转化为cDNA文库并进行深度测序。

**图2。PUM2蛋白对RNA的识别**
（A） PUM2蛋白的结构域。（B）来自非辐射或紫外线照射4SU标记细胞的放射性标记FLAG/HA-PUM2-RNA复合物SDS-gel的磷光图像。下部面板显示抗HA免疫印迹。（C） PAR-CLIP cDNA序列与ELF1和HES1 Refseq转录物的3′UTR中的相应区域对齐。显示序列读取数（#读取）和不匹配数（错误）。红色条表示PUM2识别基序，红色较小的核苷酸表示T到C序列的变化。（D）通过对前100个序列读取簇的PhyloGibbs分析生成的PUM2识别基序的序列标志。（E）所有含基序簇中锚定在8-nt识别基序上的PAR-CLIP簇的T到C位置突变频率（表S3）。虚线表示这些簇内T到C的平均突变频率。另请参见图S1。

**图3。QKI蛋白对RNA的识别**
（A） QKI蛋白的结构域（B）SDS-gel解析放射性标记RNA的磷光图像，该放射性标记RNA交联至来自未辐照或紫外线辐照4SU标记细胞的FLAG/HA-QKI IP。下部面板显示抗HA免疫印迹。（C） PAR-CLIP cDNA序列与CTNNB1和HOXD13转录物3′UTR中的相应区域对齐。红色条表示QKI识别基序，红色字母的核苷酸表示T到C序列的变化。（D）通过PhyloGibbs分析前100个序列读取簇生成的QKI识别基序的序列标识。（E）锚定在AUUAAY（左面板）和ACUAAY（右面板）RRE的PAR-CLIP簇的T到C位置突变频率（表S3）；Y=U或C。虚线表示这些簇内T到C的平均突变频率。（F）强调了具有QKI识别基序的合成4SU标记寡核苷酸的序列，这些寡核苷酸来自与（C）4SU修饰残基中所示HOXD13的3′UTR对齐的序列读取簇。（G） SDS-gel分解重组QKI蛋白与放射性标记合成寡核苷酸交联后的磷光图像，如（F）所示。（H） siRNA敲除后QKI结合转录物的稳定。两个不同的siRNA双链（1，橙色痕迹和2，黑色痕迹）用于QKI敲除，从微阵列分析中推断出与模拟转染相关的转录稳定性变化。图中显示了siRNA转染后，含有或不含有QKI PAR-CLIP簇的转录物（虚线）的变化分布。通过Wilcoxon秩和检验比较靶向和非靶向转录本的变化，得出p值。另请参见图S2。

**图4。IGF2BP蛋白家族对RNA的识别**
（A） IGF2BP1-3蛋白的结构域。（B）与FLAG/HA-IGF2BP1-3 IP交联的SDS-gel分辨放射性标记RNA的磷光成像。下图显示抗HA免疫印迹。（C） IGF2BP1 PAR-CLIP cDNA序列与EEF2和MRPL9转录物的3′UTR的相应区域对齐。红色条表示4-nt IGF2BP1识别基序，红色标记的核苷酸表示T到C序列的变化。（D）通过PhyloGibbs分析前100个序列读取簇生成的IGF2BP1-3 RRE的序列标志。（E）所有含基序簇中锚定在4-nt识别基序上的PAR-CLIP簇的T到C位置突变频率（表S3）。虚线表示这些簇内T到C的平均突变频率。（F）重组IGF2BP2蛋白与野生型（左图）和突变目标寡核苷酸（右图）的天然PAGE分解复合物的磷光图像。序列和离解常数（K_d日)显示。（G） siRNA敲除后IGF2BP结合转录物的失稳。使用靶向IGF2BP1、2和3的三个siRNA双链混合物，以及模拟转染，并通过微阵列分析监测转录稳定性的变化。显示了IGF2BP1-3 PAR-CLIP靶转录物与非靶转录物的转录水平变化分布。对IGF2BP1-3靶序列进行排序并将其划分为多个仓。p值表示目标转录物与非目标转录物变化之间差异的显著性，如Wilcoxon秩和检验所示，并针对多重检验进行了校正。参见图S3和S4。

**图5。AGO蛋白家族和TNRC6家族PAR-CLIP**
（A） SDS-凝胶的磷光成像，用于分辨与FLAG/HA-AGO1-4和FLAG/HA-TNRC6A-C IP交联的放射性标记RNA。下部面板显示带有抗HA抗体的免疫印迹。（B） AGO PAR-CLIP cDNA序列的比对读取到PAG1和OGT的3′UTR的相应区域。红色条表示8-nt miR-103种子互补序列，红色标记的核苷酸表示T到C突变。（C）从未经处理的HEK293细胞、非交联的FLAG/HA-AGO1-4 IP和组合的AGO1-4 PAR-CLIP文库中分离的RNA的miRNA图谱。色码表示通过排序确定的相对频率。用红色表示的miRNA被反义寡核苷酸抑制，以在转录组范围内表征miRNA结合的失稳效应。（D） miRNA序列读取的T到C位置突变频率以黑色显示，尿苷类在miRNA中的标准化出现频率以红色显示。红色虚线表示miRNA中标准化平均U频率。另请参见图S5。

**图6。AGO PAR-CLIP识别HEK293细胞中的miRNA种子互补序列**
（A）在PAR-CLIP CCR中表示10个最显著富集的7聚体序列。T/C表示序列读取集群中主要的T到C转换。（B）从包含种子互补序列的所有簇到HEK293细胞中任何前100个表达的miRNAs的7 mer种子互补序列（miRNA的位置2-8）上的序列读取簇的T到C位置突变频率。虚线表示集群内T到C的平均突变频率。（C）鉴定有助于miRNA靶点识别的4-nt碱基配对区域。选择了与前100个表达的miRNAs中的一个具有至少一个7-mer种子互补区的CCR。计算CCR中相对于匹配miRNA 5′端的4-nt连续匹配数。（D） CCR位置分布分析。标记为源自目标转录物的5′UTR、CDS或3′UTR的簇数显示（绿色条）。如果AGO蛋白与靶转录物无区域偏好性结合，黄色条显示交联区域的预期位置分布。另请参见图S6。

**图7。miRNA/靶RNA相互作用的各种特征与mRNA稳定性的关系**
（A）用25 2′-O-甲基修饰反义寡核苷酸混合物转染FLAG/HA-AGO2标记的HEK293细胞，抑制图5C中标记为红色的miRNAs，或模拟转染，然后对mRNA表达水平的变化进行微阵列分析。（B）包含CCR的转录物根据n聚体种子互补匹配的存在进行分类，并显示了这些类别中miRNA抑制后稳定性变化的分布。还显示了含有CCR的转录本的稳定性变化，其中没有可识别的miRNA种子互补区域。p值表示包含CCR的转录本与不包含CCR转录本的转录本之间的转录水平变化差异的显著性，如Wilcoxon秩和检验所示，并针对多重检验进行了校正。（C）转录本根据其包含的CCR数量进行分类。（D）根据CCR的位置分布对转录本进行分类。仅使用仅在指定区域包含CCR的转录本。（E） miR-15、miR-19、miR-20和let-7 miRNA家族CDS中包含7聚体种子互补区（位置2-8）的转录物的密码子适应指数（CAI）。红线和黑线表示种子互补序列的CAI，该序列包含由AGO PAR-CLIP确定的AGO蛋白结合和不结合的转录物。（F） HEK 293细胞中总转录物丰度的LOESS回归（由数字基因表达（DGE）确定的序列计数的log2）与转染miRNA拮抗剂鸡尾酒与模拟转染AGO-结合和未结合转录物后由微阵列确定的转录物丰富度的倍变（log2）。另请参见图S7。

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中的注释

为RNA-蛋白质相互作用提供新的视角。
科尔登JL。科尔登JL。化学生物。2010年4月23日；17(4):316-8. doi:10.1016/j.chembiol.2010.04.003。化学生物。2010 PMID：20416501 没有可用的摘要。
绑在信差身上。
帕斯特拉纳E。帕斯特拉纳E。自然方法。2010年6月；7(6):422-3. doi:10.1038/nmeth0610-422b。自然方法。2010 PMID：20524217

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