跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年3月3日；29(5):969-80.
doi:10.1038/emboj.2009.405。 Epub 2010年1月14日。

HDAC6控制对泛素选择性质量控制自噬至关重要的自噬体成熟

李佐勇（Joo-Yong Lee） 1, Hiroshi Koga公司, 川口义春, 外兴堂, Esther Wong（埃丝特·黄）, 亚生高, Udai B Pandey公司, 苏西米塔·考希克, 艾米丽·特雷斯, 建荣路, 保罗·泰勒, 安娜·玛丽亚·库尔沃, 左宗尧
附属公司

HDAC6控制对泛素选择性质量控制自噬至关重要的自噬体成熟

李佐勇（Joo-Yong Lee）等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

自噬主要被认为是一种由饥饿引起的非选择性降解过程。相反，营养依赖性基础自噬通过选择性处理异常的蛋白质聚集体和受损的细胞器强加细胞内质控，这是抑制神经退行性疾病的关键过程。然而，区分这两种基本自噬反应的分子机制仍然很神秘。在此，我们确定泛素结合脱乙酰酶组蛋白脱乙酰酶6（HDAC6）是靶向蛋白质聚集体和受损线粒体的基础自噬的核心成分；相反，它控制自噬体与溶酶体的融合。HDAC6通过招募一种依赖于皮质素的肌动蛋白重塑机制来促进自噬，而肌动蛋白重组机制反过来组装一个F-actin网络，刺激自噬体-溶酶体融合和底物降解。事实上，HDAC6缺乏会导致自噬体成熟失败、蛋白质聚集和神经退化。值得注意的是，HDAC6和F-actin组装对于饥饿诱导的自噬是完全不必要的，这揭示了这些自噬模式的根本区别。我们的研究确定HDAC6和肌动蛋白细胞骨架是定义QC自噬的关键成分，并揭示了自噬体-溶酶体融合水平上的自噬新调控。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1
HDAC6 KO-MEF细胞在聚集清除方面有缺陷，但在自噬体诱导或靶向方面没有缺陷。(A类)对MG132诱导的SDS不溶于泛素的聚集体进行滤器捕集分析，这些聚集体是由野生型（WT）、HDAC6 KO和KO MEF用不同的HDAC6构建物重组而成的。泛素免疫印迹（底部面板）的信号强度被量化，并表示为三个独立实验的平均值以及标准偏差（顶部）的平均值。注意，HDAC6 KO MEF和稳定表达HDAC6-CD和ΔBUZ突变体的KO MEFs中泛素阳性聚集体的显著积累。使用抗人HDAC6抗体分析稳定表达人类HDAC6（hHDAC6 WT）、HDAC6 CD（催化失活突变）或HDAC6ΔBUZ（泛素结合缺陷突变）的WT、HDAC6KO和HDAC6 KO MEF的HDAC6水平。小鼠内源性HDAC6（mHDAC6）和肌动蛋白水平由相应的抗体测定。(B类)用MG132处理WT和HDAC6 KO MEF，并对LC3、肌动蛋白和HDAC7进行Western blot分析。(C类)按照材料和方法中的描述，用MG132处理细胞，并用泛素（绿色）和LC3（红色）抗体进行免疫染色。箭头表示与LC3阳性自噬体共定位的泛素阳性聚集体。比例尺，10μm。(D类)WT和ATG5 KO MEF用2.5μM MG132处理1天，并与正常生长介质孵育18小时。MEF用抗LC3（红色）和抗泛素抗体（绿色）进行免疫染色。
图2
图2
HDAC6是高效溶酶体-自噬体融合所必需的。(A类)如图所示，用pcDNA、pcDNA-HDAC6WT、HDAC6CD或HDAC6ΔBuz以及mCherry-GFP-LC3转染野生型和HDAC6 KO MEF。黄色信号表示非酸性自噬体，红色信号表示酸性自噬菌体。比例尺，10μm。(B类)从三个独立的实验中量化黄色小泡的总数（每个>12个细胞），并以mCherry-GFP-LC3点总数的百分比（红色加黄色）以及标准偏差表示。(C类)体外融合分析。从野生型和HDAC6中纯化的自噬体（APG）和溶酶体（Lys）−/−MEF表现为异型和同型在体外融合分析（代表性字段如补充图S3所示）。值是三个独立实验（每个实验超过10张图像）的融合百分比的平均值+s.e。(D类)正常生长条件下野生型和HDAC6 KO MEF的EM图像。黄色箭头，自噬体；红色箭头，自噬体；绿色箭头，多层身体。(E类)自噬体和自噬溶酶体的定量。错误栏表示标准错误。
图3
图3
饥饿诱导的自噬不需要HDAC6。(A类)如图2A所示，使用mCherry-GFP-LC3分析野生型和HDAC6 KO MEF中饥饿或不饥饿（6小时）的自噬体-溶酶体融合。(B类)将野生型和HDAC6 KO MEFs在Hank’s溶液中培养3小时，然后用LC3、HDAC6和GAPDH抗体进行免疫印迹。(C类)野生型和HDAC6 KO MEF细胞中的长期蛋白质降解。[14C] -缬氨酸标记的长寿命蛋白是在3-甲基腺嘌呤（3MA，抑制自噬液泡的形成）存在或不存在的情况下测量的。给出了三个独立实验的平均降解率。误差栏表示标准偏差。
图4
图4
肌动蛋白重塑是基础条件下自噬体-溶酶体融合所必需的。(A类)用MG132处理野生型和HDAC6 KO MEF，并用Lamp-1（溶酶体标记物，红色）和泛素（绿色）抗体进行免疫染色，如图所示。F-actin用指骨样蛋白（蓝色）检测。箭头表示被F-actin和Lamp-1包围的泛素阳性聚集体。(B类,C类)用mCherry-GFP-LC3转染野生型和HDAC6 KO MEF，然后用LatA（100 nM）或nocodazole（250 nM）处理6 h，并如图3A所示进行分析。(D类)从喂食的小鼠肝细胞中分离出的自噬体（APGs）和溶酶体（Lys）按指示接受或不接受latrunculin（LatA）处理，广泛清洗以去除微量抑制剂，然后用抗体标记并进行在体外有无纯化肌动蛋白的融合试验。每种情况下的总融合事件数/囊泡总数如下：176/880；233/1110; 84/930; 和180/950。与未处理样品的差异在**P（P）<0.01. (E类)从喂食或饥饿的小鼠肝细胞中分离出的自噬体（APG）和溶酶体（Lys）分别用标记的latrunculin（LatA）处理或不处理，并用在体外融合分析。与未处理样品的差异在*P（P）<0.05. 每种情况下的总融合事件数/囊泡总数如下：169/1250；87/972; 190/1120; 和175/1165。(如果)从HDAC6 KO MEF中分离出的自噬体（APG）和溶酶体（Lys）按照指示接受或不接受latrunculin（LatA）治疗，并接受在体外融合测定。
图5
图5
蛋白质聚集体上肌动蛋白重塑需要自噬体。(A类)从HDAC6 KO细胞分离的自噬小室的生化特征。对从野生型（WT）中分离的不同亚细胞组分（75μg蛋白质）进行SDS-PAGE和所示蛋白质的免疫印迹。Hom，匀浆；APG，自噬体；APL，自噬体；溶酶体。(B类)从喂养的细胞中分离的自噬体（APG）和溶酶体（Lys）用标记的latrunculin（LatA）处理或不处理，并进行在体外融合分析。与未处理样品的差异在**P（P）<0.01. (C类)用MG132治疗WT和ATG5 KO MEF，并用泛素抗体（绿色）进行免疫染色，如图所示。F-actin用指骨样蛋白（红色）检测。箭头表示泛素阳性蛋白聚集体。
图6
图6
在稳态自噬中，皮质素被招募到蛋白质聚集体中，并被要求进行有效的自噬体-溶酶体融合。(A类)用MG132处理野生型和HDAC6 KO MEF，并用所示的抗皮质素（红色）、泛素（绿色）和F-actin（蓝色）的卵磷脂抗体进行免疫染色。箭头表示与F-肌动蛋白和皮质素共定位的泛素阳性聚集物。(B类)用对照或皮质素siRNA转染野生型MEF，用MG132处理，并用Lap-1抗体（红色，标记溶酶体）或泛素（绿色）和肌动蛋白（蓝色）的卵磷脂染色。注意，蛋白质聚集体的F-actin染色消失，但溶酶体仍集中在皮质素敲除细胞中（箭头所示）。(C类)用对照或皮质素siRNA转染野生型MEF，处理MG132 2.5μM 18 h，并使用泛素抗体进行过滤捕集试验。内源性皮质素的敲除水平通过使用右侧面板中的抗皮质素和GAPDH抗体进行免疫印迹来确认。(D类)用对照siRNA和皮质素siRNA转染U2OS细胞。如图3A所示，使用mCherry-GFP-LC3报告器分析饥饿（6小时）前后的自噬体-溶酶体融合。(E类)将mCherry-GFP-LC3质粒与野生型、9KQ（乙酰化修饰型）或9KR（去乙酰化修饰修饰型）皮质素表达质粒共转染到野生型MEF中。如图3A所示，对自噬体-溶酶体融合进行分析。
图7
图7
HDAC6 KO小鼠和击倒苍蝇出现自发神经退行性变和蛋白质聚集。(A类)HDAC6 KO小鼠在大脑中积累泛素阳性蛋白聚集体。用泛素抗体对6个月龄野生型和HDAC6 KO窝友的海马和大脑皮层区域进行免疫染色，并用苏木精进行复染。红色箭头表示泛素阳性神经炎聚集物，黑色箭头表示细胞质聚集物。这些泛素阳性结构在对照窝友中很少观察到。比例尺，50μm(B类)通过TUNEL染色测定HDAC6 KO小鼠皮层和海马区的凋亡细胞死亡。仅在HDAC6 KO小鼠中观察到凋亡细胞。比例尺，100μm。(C类)HDAC6消耗果蝇属眼睛导致泛素阳性病理。1日龄（d1）和30日龄（d 30）苍蝇前眼切片泛素（绿色）免疫染色。缺乏HDAC6的果蝇（GMR:GAL4/UAS-HDAC6RNAi）的眼睛发育出泛素阳性细胞质内含物，在第30天（d30）变得更加突出。蓝色，DAPI。(D类)HDAC6在果蝇属眼睛会导致年龄依赖性退化。1日龄和30日龄苍蝇的光学显微照片（左）和相应的Richardson染色的前眼切片（右）。对照果蝇（GMR:GAL4/+）和HDAC6缺失果蝇（GM R:GAR4/UAS-HDAC6RNAi）的眼睛在第1天表现出正常的高度组织化commatidial阵列；30天大的对照动物也没有表现出缺陷，但30天大的HDAC6耗竭的苍蝇表现出退化，小眼阵列紊乱，失去正常的眼睛结构（×40和×80）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Bjorkoy G、Lamark T、Brech A、Outzen H、Perander M、Overvatn A、Stenmark H、Johansen T（2005）p62/SQSTM1通过自噬降解形成蛋白质聚集体，对亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡具有保护作用。细胞生物学杂志171:603–614-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Eitzen G，Wang L，Thorngren N，Wickner W（2002）酵母液泡融合需要细胞器结合肌动蛋白的重塑。细胞生物学杂志158:669–679-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Fass E、Shvets E、Degani I、Hirschberg K、Elazar Z（2006）微管支持饥饿诱导的自噬体的产生，但不支持其靶向性和与溶酶体的融合。生物化学杂志281:36303–36316-公共医学
    1. Filimonenko M、Stuffers S、Raiborg C、Yamamoto A、Malerod L、Fisher EM、Isaacs A、Brech A、Stenmark H、Simonsen A（2007）与神经退行性疾病相关的蛋白质聚集体的自噬清除需要功能性多泡体。细胞生物学杂志179:485–500-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gao YS，Hubbert CC，Lu J，Lee YS，Lee JY，Yao TP（2007）组蛋白脱乙酰酶6调节生长因子诱导的肌动蛋白重塑和内吞作用。摩尔细胞生物学27:8637–8647-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型