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.2010年1月29日；395(4):844-59.
doi:10.1016/j.jmb.2009.10.042。 Epub 2009年10月23日。

半胱氨酸S-亚硝基化的结构分析：一种改进的酸基基序和反硝化作用的出现

斯特凡诺·马里诺 1, 瓦迪姆·格拉迪舍夫
附属公司

半胱氨酸S-亚硝基化的结构分析：一种改进的酸基基序和反硝化作用的出现

斯特凡诺·马里诺等。 分子生物学杂志. .

摘要

S-硝基化是蛋白质中一氧化氮（NO）部分与半胱氨酸（Cys）硫的选择性可逆加成，调节着许多细胞过程。近年来，发展了能够识别亚硝基半胱氨酸残基的蛋白质组学方法。然而，Cys修饰NO的特异性特征仍不明确。先前的研究表明，S-亚硝基化Cys可能由酸碱基序或疏水区域侧翼，表现出高反应性、低pK（a）和高硫原子暴露。在当前的研究中，我们用S-亚硝基硫醇制备了一个广泛的、手动管理的蛋白质数据集，解释了各种生化功能、起源生物体和对NO的生理反应。对这个通用NO-Cys数据集的分析显示，近端酸碱基序Cys pK（a）、硫原子暴露、，修饰Cys附近的Cys守恒性或疏水性并不能确定S-亚硝化的特异性。相反，这项分析揭示了一个修改后的酸碱基序，它位于Cys的更远处，并暴露了其带电基团。我们假设，修饰后的酸碱基序并非严格用于Cys的直接激活，而是参与蛋白质-蛋白质相互作用，从而有助于反硝化作用，这是具有NO部分的Cys可逆修饰的一种重要而广泛的机制。对于缺乏修正基序的蛋白质，我们讨论了替代机制，包括亚硝基谷胱甘肽作为反作用剂的潜在作用。

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数字

图1
图1。已知NO-Cys位点的计算pKa和硫原子暴露
模型指数（X轴）遵循文本中列出的蛋白质顺序，详见表S1，作为补充信息。硫原子暴露量（Y轴中的相关数值，单位：2)用红色圆圈表示，用蓝色圆圈表示pKa值（以pK为单位）。在右侧面板中，将NO-Cys的计算平均pKa（带标准偏差）与硫醇氧化还原酶（ThiolOxR）和其他含有催化Cys的酶（other Ox R）中的催化Cys进行比较。
图2
图2。NO Cys位点的氨基酸组成
A类.NO-Cys位点侧翼序列。形成NO-Cys位点的Cys残基位于零位置，上游和下游各有6个残基，以20种常见氨基酸在蛋白质中相对出现的形式显示（左侧用一个字母代码表示）。比例尺（位于两个面板下方）表示NO-Cys集合中氨基酸与Random-Cys参考集合中氨基酸的差异出现百分比。变化（由比例尺面板中蓝色和棕色的强度表示）是指残留物出现的频率（棕色）比参考Random Cys集合中相应残留物发生的频率更高或更少（绿色）的百分比值。在主面板下方，以橙色阴影显示的是发现NO-Cys周围的氨基酸最多，显示了每个位置（粗体氨基酸对应于该位置最常见的残基和最多的残基）。在小写中，显示了氨基酸，尽管这些氨基酸在随机半胱氨酸中的比例过高，但它们并不是所示位置的最常见残基。反过来，绿色阴影（第二个面板，在橙色阴影下）是NO-Cys周围最低表达的氨基酸（粗体表示氨基酸是该位置最低表达和最不常见的氨基酸）B类显示了NO-Cys硫原子4、6、8和10º范围内区域的NO-Cys的三级结构和组成分析。颜色方案如面板A所示。
图3
图3。NO-Cys位点的疏水性分析
根据Kyte-Doolittle量表分析NO-Cys数据集（即，在Y轴上，正值对应疏水环境，负值对应亲水环境）。在X轴上，模型按照表S1中的顺序订购，作为补充信息。一级结构剖面的值以蓝色菱形显示，灰色圆圈显示NO-Cys位点周围结构区域的值（定义为距NO-Cys硫原子6º内的残留物）。
图4
图4。NO-Cys位点周围结构区的氨基酸组成
A类对NO-Cys位点（左）和随机选择的Cys残基（右）的对照组进行了疏水性、正电荷和负电荷、芳香族、Cys和其他残基的分析。与暴露于距NO-Cys 8°以内溶剂的界面区域相比，显示了4、6和8°的数据（更多详细信息见正文）。B类。与两个对照Cys组（一组随机选择的蛋白质（Random Cys）和蛋白质中氨基酸的相对丰度，从网址：http://www.russell.embl-heidelberg.de/aas/.蓝色箭头指向带电残基，其在暴露的8？区域中的代表性增加（特别是在完整的8？区中，它也说明了非存在残基），而填充的灰色圆圈表示极性残基（包括His），其出现率不变。
图5
图5。NO-Cys数据集中蛋白质的对接计算
NO-Cys数据集中缺少溶剂可及的8？酸碱基基序的蛋白质的S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）对接模型。GSNO和Cys残基以棒状物表示。在每个面板中，附近的一些残留物（即靠近GSNO的残留物）被贴上标签以供参考。A类.丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（Cys 228，在线框中并标记，Cys 256）；B类GAPDH（Cys 150）；C.PRX2（Cys 121）；D类.β-管蛋白（Cys 12）；E类组蛋白脱乙酰酶（Cys 262）。表2中给出了相关的热力学和几何参数。
图6
图6。GSTt二聚化界面区
大鼠GSTt二聚化复合物的分子模型。这两个单体以不同的颜色方案以卡通形式显示。一个单体的Cys 50显示在spacefill中，而附近的Lys 149（属于另一单体）显示在sticks表示中。灰色区域描述了（在半透明分子表面可视化中）文本中详细描述的疏水囊。
图7
图7。NO-Cys站点的B因子分析
上部面板显示NO-Cys位点的计算B因子值（即数据集蛋白质，表S1），下部面板显示相同蛋白质中所有其他Cys的B因子值。NO-Cys单独显示为蓝色，接近Cys的氨基酸的平均值（6℃以内，显示为6A RC）显示为红色，蛋白质的平均B因子值显示为绿色。在X轴上，模型索引号是指按照表S1（上部面板）中的顺序排列的NO-Cys，或按照N端到C端方向排列的相同蛋白质的所有Cys：因此，对于表S1中的每个蛋白质，所有Cys（不包括NO-Cys本身）在图中以N端到C-端的顺序列出。
图8
图8。S-亚硝化对静电势分布的影响
在溶剂可及表面上绘制的静电势分布图显示了四种蛋白质，其晶体结构可用于S-亚硝基化和非修饰形式。上排显示非修饰蛋白质，下排显示NO-Cys的相应结构。A） 黑鳍金枪鱼肌红蛋白；B） 人TRX1；C） 人血红蛋白（B链）；D） 人PTP1b。这些蛋白质的PDB代码是（第一个数字对应于NO-Cys-containing蛋白质，第二个数字对应非修饰蛋白质）：肌红蛋白（2NRM和1MYT）、TRX1（1ERU、2HXK）、血红蛋白（1BUW和1A3N）和PTP1B（3EU0和2F6F）。电势范围为每质子电荷−2.5 kT（红色）到每质子电荷+2.5 kT（蓝色）。蛋白质以修饰的Cys（如图所示，在半透明蛋白质表面下方用黄色填满）面向读者。
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