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.2009年6月1日；185(5):811-26.
doi:10.1083/jcb.200810133。

Pygo2通过促进组蛋白H3 K4甲基化来扩大乳腺祖细胞

顾炳南 1, 孙鹏（音译）, 袁阳元, 里卡多·C·莫莱斯, 李爱华, 安迪·滕, 安舒·阿格拉瓦尔, 凯瑟琳·雷奥姆, 弗吉尼亚·比兰科内, 杰奎琳·M·维尔特马特, Ken-Ichi Takemaru先生, 萨拉·米勒, 伊娃·Y-H·P·李, 迈克尔·T·刘易斯, 李博安, 邢代
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Pygo2通过促进组蛋白H3 K4甲基化来扩大乳腺祖细胞

谷炳南等。 J细胞生物学. .

摘要

最近的研究明确地确定了乳腺中的多能干/祖细胞，提供了一个易于驾驭的模型系统，以揭示上皮干细胞/祖细胞发育和体内平衡的遗传和表观遗传调控。在这项研究中，我们发现Pygo2是一个进化上保守的植物同源结构域蛋白家族的成员，在胚胎和出生后的乳腺祖细胞中表达。Pygo2缺乏症是通过完全或上皮特异性基因消融在小鼠体内实现的，它会导致乳腺形态发生和再生缺陷，伴随着上皮祖细胞的扩张性自我更新严重受损。Pygo2在祖细胞调节和细胞周期基因表达上与Wnt/beta-catenin信号融合，上皮细胞Pygo 2的缺失完全挽救了由beta-catenin诱导的乳腺生长。我们进一步描述了Pygo2的一种新的分子功能，它是乳腺祖细胞扩增所必需的，通过与K4-甲基组蛋白H3直接结合并招募组蛋白H3-K4甲基转移酶复合物，在全球和Wnt/beta-catenin靶位点促进组蛋白H4的K4三甲基化。

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数字

图1。
图1。
Pygo2在乳腺上皮祖细胞中的表达。（A、C和F）显示胚胎（A）、青春期（C）和妊娠（F）乳腺解剖特征的示意图。（B，左）Pygo2在E15.5乳腺芽中强烈表达，尤其是在鳞茎区域（星号）。插图是显示Pygo2核定位的放大图像。白色虚线表示基底膜将上皮和间充质隔开。信号缺失Pygo2号−/−乳腺芽（右）证实抗体特异性。箭头指向表达Pygo2的间充质细胞。（D） Pygo2在帽中的表达（由角蛋白14勾勒+或K14+; 箭头）和3周龄雌性TEB的体细胞（用星号表示）。（E） 6周龄乳腺上皮中Pygo2的表达。注意，当细胞离开TEB时，Pygo2表达减少（箭头）。（G） 妊娠18.5天乳腺小叶肺泡细胞中普遍存在Pygo2表达。D/E和G的剖面分别由C和F中的虚线表示。WT，野生型。棒材：（B）30µm；（D和E）25µm；（G） 50微米。
图2。
图2。
Pygo2缺陷小鼠的胚胎和出生后乳腺表型。（A） E18.5野生型（WT；顶部）和Pygo2号−/−（底部）胚胎显示选定的单个乳腺（MG）。（B） 从多个突变胚胎获得的所有十个腺体的结果摘要(n个= 4). 突变型和野生型的平均分枝点分别为3.25±0.63和6.5±1.04（星号；P=0.04）。（C） E11.5 K14-Cre/Rosa26R胚胎的整装LacZ染色皮肤制剂。板3的横截面（箭头）显示在底部。（D） 一只3周龄K14-Cre/Rosa26R雌性大鼠的乳管（顶部）和TEB（底部）的LacZ染色横截面（用苏木精和曙红复染）。（E） 基因组PCRPygo2号在表皮而不是真皮或其他组织中显示重组的等位基因。Co，结肠；De，真皮；表皮；他，心；In，肠；Li，肝脏；卢，肺；St，胃。加号和减号表示PCR的控制。（F） 处女SSKO乳腺导管上皮和TEB（插图）中无Pygo2。（G和H）胭脂红染色的乳腺全山制剂4，从3周龄开始(n个= 4; G） 和6周大(n个= 3; H） 女性。注意突变体中没有TEB结构（G中的短箭头）和缺陷的导管延伸（H中的长箭头标记）。显示的对照基因型为K14-Cre/Pygo2号弗洛克斯/+（F和G）和Pygo2号弗洛克斯/+（G） ●●●●。棒材：（A）112µm；（C） 30微米；（D和F）25µm；（G） 107微米；（H） 937微米。
图3。
图3。
Pygo2号SSKO乳腺上皮含有较少的干/祖细胞。（A） FACS分析结果显示Lin数量减少−CD24型+CD29型高10周龄Pygo2缺陷乳腺中的细胞。左侧显示了单个对的典型FACS剖面，右侧显示了三个不同对的平均值。（B） 减少K6的存在+8周龄Pygo2缺陷乳腺导管和导管末端的祖细胞（插图）。（C） ER表达不受Pygo2丢失的影响。（D） 9–12周龄对照组或Pygo2号美国特种部队(n个=6）小鼠。（E） 从8周龄SSKO小鼠分离的MEC在Matrigel培养中的集落形成和K6表达减少。定量分析（右）显示K6的数量在统计学上显著减少+菌落和K6+每个阳性集落的细胞数。显示的对照基因型有两种Pygo2型弗洛克斯/+和一个野生型（A），Pygo2号弗洛克斯/+（B） ，K14-Cre/Pygo2型弗洛克斯/+（C） ，四个Pygo2号弗洛克斯/+和两个K14-Cre/Pygo2号弗洛克斯/+（D） 和两个K14-Cre/Pygo2号弗洛克斯/+和一个Pygo2号弗洛克斯/+（E） ●●●●。（A和E）误差线代表标准偏差。棒材：（B和C）25µm；（E） 37.5微米。
图4。
图4。
Pygo2缺失导致乳腺上皮增生减少，G1-S转变受损。（A） E15.5对照组和对照组乳腺芽中BrdU掺入的免疫组织化学检测Pygo2号−/−胚胎。右侧显示了BrdU标记指数，即BrdU阳性细胞占乳腺芽细胞总数的百分比。P<0.001。虚线表示基底膜。WT，野生型。（B） 高密度培养中Pygo2缺失的MCF10A细胞生长减少。（C） 减少Pygo2耗竭细胞的集落形成。（D） 对照细胞和Pygo2缺失细胞的细胞周期分析。（E） Pygo2缺失细胞中细胞周期基因的表达改变。在siRNA转染后第3天收集mRNA，并通过定量RT-PCR进行定量。（A–C和E）误差线代表标准偏差。棒材，20µm。
图5。
图5。
Pygo2是乳腺上皮中Wnt/β-catenin靶基因表达所必需的。（A和B）全套LacZ染色Pygo2号E11.5（A）和E15.5（B）的野生型（WT；顶部）和缺陷型（底部）BAT-gal胚胎。箭头旁边的数字（2和3）表示乳腺芽2和3。方框区域的相应部分显示在右侧。闭合箭头和开放箭头分别表示外部可见和不可见的乳腺。（C） 全贴装原位杂交勒夫1E13.5野生型和突变型胚胎。（D） 定量RT-PCR结果显示减少勒夫1中的表达式Pygo2号SSKO乳腺(n个= 3). 误差栏表示标准偏差。棒材：（A）195µm；（B） 315微米；（C） 900微米；（插图）20µm。
图6。
图6。
Pygo2缺失可挽救K14-ΔN–β-catenin小鼠的乳腺发育不良表型。（A） 12周龄野生型（WT）和K14-ΔN–β-catenin乳腺的整体胭脂红染色(n个=5）雌性。（B和C）K14-ΔN–β-catenin（12周龄；B，右侧）和抄送1−/−（39周龄；C，右）小鼠。K14染色勾勒出基底室。插图显示了TEB的图像。（D） 12周龄K14-ΔN–β-catenin和K14-△N–β-catenin的整张胭脂红染色皮肤/Pygo2号SSKO公司(n个=4）室友。（E） 分支点的定量分析。误差线表示标准偏差。β-cat、β-catenin。棒材：（A和D）500µm；（B和C）25µm。
图7。
图7。
Pygo2的H3K4me2/3结合活性是乳腺祖细胞形成集落所必需的。（A） Pygo和ING2/溴结构域PHD指转录因子（BPTF）蛋白中PHD指的序列比对。注意，ING2中H3K4me3结合的关键残基和溴代多巴胺PHD指转录因子（以红色突出显示）在Pygo PHD中是保守的。BCL9结合所需的残留物以蓝色突出显示。星号代表C的保守半胱氨酸和组氨酸氨基酸4HC公司三博士。（B） 小牛胸腺组蛋白下拉物考马斯蓝染色。（C） 用抗单甲基、二甲基和三甲基H3 K4抗体对B中的下拉样品进行Western blot分析。（D） 293T细胞中Pygo2–H3K4me3相互作用的免疫共沉淀/Western blot分析。（E） 组蛋白H3 N末端肽的下拉，用抗GST抗体的Western blotting分析洗脱液。（F） H3K4me3（b）或BCL9 HD1（c）相互作用所需的Pygo2 PHD中的残基定位。（a） GST、GST–Pygo2 PHD衍生物和细菌纯化的6×His–BCL9 HD1结构域蛋白的考马斯蓝染色。用抗H3K4me3（b）的Western blotting分析组蛋白的GST下拉，而用抗GST抗体（c）分析GST-PHD衍生物的镍下拉。（G） H3K4me3–Pygo2–BCL9之间的协同作用。纯化的蛋白质按照指示进行孵育，并用镍珠拖出，洗脱液用指示的抗体进行蛋白质印迹分析。（H） Pygo2的甲基组蛋白H3结合是MCF10A细胞形成集落所必需的。（a） 显示了显示外源Pygo2衍生物影响的典型图像。（b） 三个独立实验的量化。误差条表示标准偏差。*，P=1.0；**，P=0.045；，P=0.010；和†，P=0.030。使用双尾法计算P值t吨假设方差相等的测试。请注意，野生型和突变型2×Flag标记的Pygo2蛋白在感染细胞中的表达水平相似（c）。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。
图8。
图8。
Pygo2通过促进WDR5的染色质结合来调节H3K4me3水平。（A） Pygo2对MCF10A细胞中全局H3K4me3的需求。用30 nM对照siRNA处理的细胞中的H3K4me3/H3比率被任意设置为1。（B） Western blot分析表明，Pygo2基因敲除特异性影响H3 K4的二甲基化和三甲基化。（C） 降低H3K4me3水平Pygo2型SSKO乳腺。野生型腺体中的H3K4me3/H3比率被任意设置为1。（D） ChIP实验结果显示c-Myc增强子和勒夫1发起人。注意，这些位点的总H3水平没有受到显著影响。（E） 293T细胞中Pygo2与WDR5的相关性（有或无BIO治疗）。（F） Pygo2–WDR5在MCF10A细胞中的相互作用。星号标记交叉反应的IgG。（G） 敲低MCF10A细胞中Pygo2后WDR5染色质结合减少。星号表示交叉反应带。WCE，全细胞提取物；S2，可溶性胞质部分；S3，可溶核分数；P3，染色质富集部分。（H） ChIP分析显示c-Myc增强子和勒夫1Pygo2-depleted MCF10A细胞中的启动子。（D和H）误差线代表标准偏差。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。
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