Purification of proteins associated with specific genomic Loci

doi:10.1016/j.cell.2008.11.045

.2009年1月9日；136（1）：175-86。

doi:10.1016/j.cell.2008.11.045。

与特定基因组位点相关的蛋白质的纯化

杰罗姆·德贾丁¹, 罗伯特·金斯顿

附属公司

PMID： 19135898
预防性维修识别码：项目经理3395431
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2008.11.045

与特定基因组位点相关的蛋白质的纯化

杰罗姆·德贾丁等。单元格. 2009.

.2009年1月9日；136(1):175-86.

doi:10.1016/j.cell.2008.11.045。

作者

杰罗姆·德雅尔丁¹, 罗伯特·金斯顿

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系，邮编02114。

PMID： 19135898
预防性维修识别码：项目经理3395431
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2008.11.045

摘要

真核DNA在染色质的背景下被许多蛋白质复合物结合和解释。对调控特定位点的全套蛋白质的描述对理解调控至关重要。在这里，我们描述了一个称为分离染色质片段蛋白质组学（PICh）的协议，该协议解决了这个问题。PICh使用特定的核酸探针分离基因组DNA及其相关蛋白，其数量和纯度足以鉴定结合蛋白。使用PICh纯化人类端粒染色质，确定了大多数已知的端粒因子，并发现了大量新的关联。我们比较了端粒（ALT）通路选择性延长所维持的端粒上的蛋白质与端粒酶所维持的与端粒结合的蛋白质。我们鉴定并验证了几种与ALT端粒特异结合的蛋白质，包括孤儿核受体，从而使PICh成为表征染色质组成的有用工具。

PubMed免责声明

数字

**图2。转化人细胞系端粒染色质的纯化**
（A）从PICh纯化的端粒染色质获得的材料的银染色。两个HeLa克隆的纯化(*第3章*和*第1.2.11条*)和*WI38-VA13型*显示ALT细胞系。T：用端粒特异性探针进行PICh。S：使用“加扰”探针执行PICh。投入占原料的0.001%（3×10⁴细胞当量），纯度为5×10⁸单元当量/车道。（B）通过免疫染色验证选定的PICh与ALT端粒的相关性。蛋白质名称后面是它们在ALT列表中的排名顺序。NXP2是一种暂时转染的HA标记构建物（转染后48小时进行实验）。使用特定抗体检测内源性RIP140和Fanc-J。（C）与标记HMBOX1和RAP1的联合免疫染色*WI38-VA13型*和*赫拉1.2.11*细胞系（转染后72小时）。（B和C）右侧的量化表示为细胞核分数，该分数显示了分析人群中端粒与测试蛋白质共定位的程度。

**图3。COUP-TF2、COUP-TF1和TR4与WI38-VA13 ALT端粒的关联分析**
（A）含抗COUP TF2和抗TR4抗体的CHIP。免疫沉淀DNA（来自*VA13型*或*赫拉1.2.11*)使用端粒特异性探针（端粒）或Alu探针（Alu）在slot-blot上进行检测。输入占起始材料的0.002%。已加载20%的IP。右侧面板显示了两个独立实验的量化结果（误差条表示富集值的SD）。显示了PICh纯化端粒（负载6%）上COUP TF2和TR4的免疫印迹。（B） Western blot分析从所示细胞系纯化的材料中COUP TF2和TR4的水平；TRF2是端粒材料的负载控制。（C）免疫印迹显示COUP-TF、COUP-TF1和TR4蛋白水平*赫拉1.2.11*或*VA13型*细胞裂解物。探讨β-微管蛋白对负荷的控制作用。（D）免疫荧光原位杂交（COUP-TF和端粒探针）和RAP1和TR4或COUP-TF1的联合免疫抑制*第13页*核。同位化频率如右图所示。

**图4。VA13中期传播中孤儿受体与Shelterin蛋白的联合免疫染色**
顶部面板：COUP-V和TRF2。底部面板：TR4和RAP1。

**图5。端粒的核小体密度和组成**
（A）类似数量的遮蔽物*赫拉1.2.11*或*第3章*加载以比较核小体组蛋白和庇护蛋白信号。（B）含抗H3抗体的CHIP。免疫沉淀DNA（来自HeLa第3章或*1.2.11*)使用端粒特异性探针（端粒）或Alu探针（Alu）在slot-blot上进行检测；右边的面板显示了两个独立实验的定量结果。输入占起始材料的0.002%。已加载20%的IP。右侧面板显示定量标准化，以输入端粒DNA和Alu重复的H3 IP（误差条表示富集值的SD）。（C）含抗H1和抗H3抗体的CHIP。免疫沉淀DNA（来自*VA13型*或*赫拉1.2.11*)使用端粒特异性探针（端粒）或Alu探针（Alu）在slot-blot上进行检测；右边的面板显示了两个独立实验的量化结果（误差条表示富集值的SD）。输入占起始材料的0.002%。已加载20%的IP。利用利用Alu重复序列为这些蛋白质获得的信号，对端粒的H1和H3富集进行标准化。

**图6。孤儿受体与ALT端粒结合的可能情况**
R：嘌呤（A或G），DR：直接重复。端粒变异重复序列的组合可能构成孤儿受体的结合位点，孤儿受体与端粒结合后，靶向PML-NB位点。

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