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.2008;3（11）：e3554。
doi:10.1371/journal.pone.0003554。 Epub 2008年11月3日。

视觉功能需要内源性VEGF：müller细胞和感光细胞存活作用的证据

马加里·圣杰尼兹 1, 阿林德尔·S·R·马哈拉吉, 托尼·E·沃尔什, 巴德·塔克, Sekiyama先生, Tomoki Kurihara公司, 黛安·达兰德, 迈克尔·J·杨, 帕特里夏·德阿莫尔
附属公司

视觉功能需要内源性VEGF：müller细胞和感光细胞存活作用的证据

马加里·圣杰尼兹等。 公共科学图书馆一号. 2008.

摘要

背景：血管内皮生长因子（VEGF）因其在正常和病理新生血管形成中的作用而广为人知。然而，越来越多的证据表明，VEGF也作用于非血管细胞，无论是在发育过程中还是在成人体内。鉴于系统性和眼内抗血管内皮生长因子治疗广泛用于治疗与肿瘤生长和湿性黄斑变性相关的血管生成，系统研究血管内皮生长激素在成人视网膜中的作用至关重要。

方法和结果：利用免疫组织化学和Lac-Z报告小鼠系，我们报告了VEGF由成年小鼠视网膜中的各种细胞产生，并且VEGFR2（主要信号受体）也广泛表达，通过Müller细胞和光感受器强烈表达。通过腺病毒表达sFlt1在小鼠体内实现了VEGF的系统中和。VEGF中和14天后，对视网膜内外血管系统没有影响，但内外核层细胞凋亡显著增加。到四周时，神经细胞死亡增加与内外核层厚度减少以及视网膜电图测量的视网膜功能下降有关。体外Müller细胞系中基于siRNA的VEGF表达抑制支持VEGF在Müler细胞生存中的自分泌作用。同样，将外源性VEGF添加到新分离的感光细胞和外核层外植体中，表明VEGF具有高度的神经保护作用。

结论：这些结果表明内源性VEGF在成人视网膜神经元细胞的维持和功能中起着重要作用，并表明抗VEGF治疗应谨慎使用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。成人视网膜中的VEGF信号。
（A） 成人眼睛切片VEGF-lacZ公司用x-gal（蓝色）对小鼠进行LacZ染色，发现VEGF在GCL（箭头）和INL层（星号）表达。（B） 成年VEGF-lacZ小鼠的扁平安装视网膜染有lacZ（蓝色）和NG2（棕色），显示GCL中与微血管（箭头）相关的NG2阳性细胞和一些星形胶质细胞（箭头）表达VEGF。（C） 成人眼睛切片VEGFR2-lacZ（血管内皮生长因子受体2）对小鼠进行lacZ染色后，发现VEGFR2在GCL、INL（星号）和感光细胞中表达，在感光细胞的内节中观察到强烈的lacZ着色（箭头）。（D） 成人视网膜切片中VEGFR2的免疫组织化学显示，VEGFR2在血管细胞（箭头）、Müller细胞过程和感光细胞的IS中表达（箭头）。（E） VEGFR1的免疫组化显示，在IPL和OPL中有斑点表达。VEGFR2也在光感受器IS中检测到。（F）使用CRALBP对Müller细胞进行染色，显示出类似于VEGFR2的表达模式（与D相比）。（G） 成年大鼠视网膜和分离的大鼠米勒细胞RNA的RT-PCR证实了米勒细胞表达VEGF及其受体VEGFR1和VEGFR2。（H） VEGFR1和VEGFR2在成年小鼠视网膜光感受器（PR）中的表达。（I） 从合并的成年小鼠视网膜中进行VEGFR2的免疫沉淀（IP），然后进行磷酸化酪氨酸的免疫印迹，揭示了成年视网膜中VEGFR2的表达（下图）和激活（上图）。作为对照，对过度表达VEGFR2的猪主动脉内皮（PAE）细胞裂解物进行免疫沉淀和免疫印迹，无论是未经处理的还是用VEGF刺激的。GCL：神经节细胞层，IPL：内丛状层，INL：内核层，OPL：外丛状层；ONL：外核层，IS：内段，OS：外段。比例尺为100µm。
图2
图2。VEGF中和作用不会影响视网膜血管灌注或渗透性。
感染Ad-null或Ad-sFlt1 14天的小鼠灌流h.m.w荧光素-右旋糖酐（绿色），然后解剖眼睛，（A）平装或（B）切片并免疫染色IV型胶原，用Cy3-结合二级抗体（红色）观察。（A） 与表达Ad-null的对照小鼠（n=6只小鼠/条件）相比，表达sFlt1的小鼠经荧光素-右旋糖酐灌注后的扁平视网膜没有出现明显异常或灌注缺陷，视网膜内部的毛细血管密度也没有变化。（B） 荧光素灌注视网膜切片中IV型胶原的免疫荧光定位显示，在Ad-null和Ad-sFlt1中，FITC-右旋糖酐和IV型胶原几乎完全覆盖视网膜内血管（箭头，第三栏）。（C） 与Ad-null（n=4）相比，Ad-sFlt1（n=5）中最内层视网膜血管荧光素和IV型胶原阳性血管的定量显示灌注血管的数量没有减少，表明没有血管损伤。（D） 感染7天后，实验小鼠的荧光素血管造影显示，两组注射后4-5分钟玻璃体均无混浊，表明视网膜血管通透性无变化（n=6只小鼠/条件）。比例尺A为1 mm，B为100µm。
图3
图3。全身VEGF阻断不会改变视网膜血管超微结构或脉络膜毛细血管开窗。
（A） 第14天，sFlt1表达小鼠GCL中的微血管TEM显示内皮细胞核和细胞质的超微结构正常。特征性的电子密集紧密连接非常清晰（箭头所示）。（B） Ad-sFlt1感染14天后，视网膜外段的TEM显微照片显示正常的RPE-脉络膜复合体。RPE基底内折致密，与Bruch膜（BM）紧密相关。脉络膜毛细血管未显示膜增厚。未发现血栓形成迹象。（C） 高倍放大的脉络膜毛细血管显示，面对RPE的内皮膜上有许多开窗（箭头所示）。（D） 在感染后28天，通过TEM显微照片对脉络膜毛细血管（箭头）的内皮开窗进行量化（n=3只小鼠/条件）。在Ad-null和Ad-sFlt1小鼠之间没有观察到绒毛膜毛细血管开窗数量的变化。比例尺在A–B中为5µm，在C中为0.5µm和在D中为1µm。
图4
图4。VEGF中和导致视网膜细胞死亡增加。
（A） TUNEL染色显示，感染14天后Ad-sFlt1小鼠的INL和ONL细胞凋亡均显著增加（n=4只小鼠/条件）。（B） 对表达sFlt1的小鼠视网膜切片进行TUNEL染色和苏木精复染的高倍图像显示，INL和ONL中凋亡细胞的数量显著增加。GCL：神经节细胞层，INL：内核层，ONL：外核层，OPL：外丛状层，Ch：脉络膜。比例尺在A中为100µm，在B中为50µm。
图5
图5。表达sFlt1的小鼠视网膜厚度降低和视觉功能丧失。
（A） 来自表达sFlt1 28天的实验小鼠视网膜的半薄epon切片显示INL（黑色双箭头线）和ONL（白色双箭头线）显著变薄（对于Ad-null，n=3，对于Ad-sFlt1，n=4）。第28天表达sFlt1小鼠视网膜的（B–D）TEM。（B–C）在INL区域拍摄的显微照片显示凋亡的Müller细胞（MC）和无长突细胞（A）。两个细胞都出现染色质凝集、膜肿胀和线粒体断裂（箭头所示）。（D） 在ONL中，高百分比的感光细胞出现凋亡（白色星号）。细胞死亡留下了许多含有膜状碎片（箭头）的空白空间。通常充满细胞间隙的米勒细胞的突起出现收缩（MP）。（E） 感染后28天，用+10 dB的闪光强度对实验小鼠进行的Scotopic ERG记录显示，sFlt1表达小鼠的a波和b波振幅显著降低（Ad-null为6，Ad-sFlt1为10）。GCL：神经节细胞层，INL：内核层，ONL：外核层，OPL：外丛状层，Ch：脉络膜。比例尺在A中为100µm，在B到D中为5µm。
图6
图6。抑制Müller细胞自分泌VEGF信号导致细胞死亡增加。
通过将siRNA转染到亚融合细胞中，MIO-M1米勒细胞的VEGF表达受到抑制。（A–B）转染对照和VEGF siRNA 72小时后，用qPCR（A）测定VEGF mRNA水平，用ELISA（B）定量VEGF蛋白分泌。siVEGF转染导致VEGF mRNA抑制75%，VEGF蛋白减少90%以上（n=3）。（C） 在无血清条件下培养三天后，VEGF的抑制与TUNEL阳性细胞的增加有关（n=4）。（D） FACS分析对细胞死亡的量化显示，与siControl相比，siVEGF转染细胞中annexin-V阳性凋亡细胞的数量增加了一倍（n=3）。（E） 凋亡增加伴随着促凋亡基因的显著上调，bax基因，并且随着巴克斯/Bcl-2型比率（F）。比例尺为100µm。
图7
图7。VEGF是光感受器的直接生存因子。
（A） 将从成年C57BL/6J小鼠分离的光受体培养在层粘连蛋白包被的孔上，在没有或存在10 ng/ml VEGF165的情况下培养72小时。添加10 ng/ml VEGF 165可减少台盼蓝染色确定的死亡细胞数量。（B） 根据台盼蓝排斥试验对死亡感光细胞百分比进行量化，结果显示VEGF165对细胞凋亡具有显著的保护作用（n=9）。（C） 仅含有感光细胞核和IS的ONL外植体在±10 ng/ml VEGF165的基础培养基中培养24、48和72小时。TUNEL染色检测凋亡细胞。（D） 每片TUNEL阳性细胞的定量显示，VEGF存在时凋亡感光细胞的数量显著减少（n=6）。
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