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.2008年8月；19(8):3357-68.
doi:10.1091/mbc.e08-03-0319。 Epub 2008年5月21日。

肌球蛋白II在脑胶质瘤侵袭中的作用

克里斯托弗·比德尔 1, 马塞拉·阿萨纳, 帕斯卡尔·蒙佐, 理查德·瓦利, 史蒂文·罗森菲尔德, 彼得·卡诺
附属公司

肌球蛋白II在脑胶质瘤侵袭中的作用

克里斯托弗·比德尔等。 摩尔生物细胞. 2008年8月.

摘要

胶质瘤侵袭大脑的能力限制了标准疗法的疗效。在这项研究中，我们使用两种新的体内模型系统检测了活脑组织中胶质瘤的迁移。在脑内，胶质瘤细胞像未转化的神经前体细胞一样迁移，延伸出一个突出的主导细胞质过程，随后需要肌球蛋白II的细胞体突然向前运动。相反，在二维表面上，神经胶质瘤细胞更像成纤维细胞一样迁移，并且它们不需要肌球蛋白II来移动。为了解释这一现象，我们研究了胶质瘤通过一系列具有确定孔径的合成膜的迁移。我们的结果表明，当胶质瘤细胞必须挤入小于其核直径的孔时，肌球蛋白II的A和B亚型是特别需要的。他们支持这样一种模型，即神经胶质瘤侵袭的神经祖细胞样模式和肌球蛋白II的需求代表了大脑内移动所需的适应，大脑具有亚微米的有效孔径。此外，脑侵袭对肌球蛋白II的绝对需求强调了这种分子马达作为治疗恶性脑肿瘤的新型抗侵袭疗法的潜在靶点的重要性。

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数字

图1。
图1。
PDGF转化、GFP表达的大鼠胶质瘤细胞的脑迁移。注射后10天，对PDGF驱动肿瘤的300μm厚切片培养物进行时间推移显微镜检查。（A） Kymograph是根据5小时内每15分钟拍摄一次的图像构建的，显示了神经胶质瘤细胞向皮层浸润时的跳跃运动；红色箭头指向细胞核移位前主导过程中形成的细胞质肿胀。（B） 切片用50μM镇静剂处理后，皮层中细胞的Kymograph（每15分钟拍摄一次图像）。注意，细胞体保持静止，而主要的细胞质过程继续向前延伸。（C和D）细胞的迁移路径（红线），不含（C）和（D）添加50μM泡状抑素。通过标记细胞体在连续时间点的位置，追踪肿瘤浸润边缘（T）和上覆皮层（CX）的单个细胞的迁移路径（红线）（红点对应于细胞体每隔30分钟的位置）。（E） 时间序列（每隔3分钟拍摄一次显微照片）显示了细胞体移位期间的细胞体变形。红色箭头指向细胞体和前导过程中的肿胀之间发生的局部变窄，细胞体向前移动时通过肿胀收缩。（F和G）GFP（绿色）和DAPI（蓝色）染色固定切片的显微照片，显示GFP表达细胞在迁移序列的不同阶段。F–F〃显示一个细胞，细胞核（白色箭头）与前导过程中的显著扩张（黄色箭头）分离。G–G〃表示细胞体和细胞核发生局部变形（红色箭头）。棒材，10μm。
图2。
图2。
脑胶质瘤中肌球蛋白II亚型的表达。（A） 来自胶质瘤细胞和人类组织裂解物的免疫印迹肌球蛋白II亚型。β-肌动蛋白作为负荷对照。（B） 与未注射对侧脑相比，脑内注射PDGF-IRES-GFP编码逆转录病毒产生的大鼠胶质瘤模型裂解物中肌球蛋白II亚型表达的比较。对三个分离的大鼠大脑的切除物进行免疫印迹分析。（C） ●●●●。肌球蛋白IIA和肌球蛋白ⅡB siRNA-转染的U251细胞的免疫印迹分析显示每种亚型减少>95%。以无义siRNA寡核苷酸作为对照。
图3。
图3。
肌球蛋白IIA和IIB在正常大鼠脑和PDGF驱动的脑肿瘤模型中的定位。（A） 低倍显微照片显示肌球蛋白IIA（红色）在荷瘤大鼠对侧正常半球的分布。肌球蛋白IIA染色的缺乏与图2B中的免疫印迹结果一致。（B） 低倍显微照片显示肌球蛋白IIB（红色）在对侧正常半球的分布。肌球蛋白IIB广泛分布于未累及半球的皮质和白质中。（C） 荷瘤半球的低倍显微照片，用肌球蛋白IIA抗体染色。与周围脑组织、皮层（CX）、纹状体（Str）和胼胝体（CC）相比，肿瘤（T）中肌球蛋白IIA的染色增强。肿瘤血管的染色水平特别高（白色箭头）。Bar，1 mm。（C′-C‴）高倍显微照片，显示浸润皮层的GFP表达细胞（绿色）中肌球蛋白IIA（红色）的免疫染色。细胞核被DAPI染成蓝色。棒材，10μm。（D） 肿瘤半球肌球蛋白IIB（红色）的低倍显微照片。肿瘤血管中的肌球蛋白IIB免疫反应水平增加（白色箭头），而在大多数肿瘤（T）中，肌球蛋白II免疫反应水平与周围脑组织相似。（D′–D‴）高倍显微照片，显示GFP表达细胞（绿色）浸润皮层的肌球蛋白IIB免疫反应性（红色）。细胞核被DAPI染成蓝色。C和D中的白色箭头指向坏死区域（N）周围的肿瘤血管。
图4。
图4。
人脑胶质瘤异种移植具有侵袭性，肌球蛋白IIA表达增强。（A） 裸鼠全脑贴装，注射来源于人类胶质母细胞瘤的原代培养物。白色箭头表示肿瘤接种位置。对组织样本进行人类核抗原（绿色）染色，以显示人类肿瘤细胞在大鼠背景中的位置。肿瘤已扩散至胼胝体（CC）至对侧白质，位于皮质（CX）和纹状体（Str）之间。Bar，1 mm。（B）肌球蛋白IIA的免疫荧光定位显示，接种部位对侧的白质中浸润性肿瘤明显染色。Bar，1 mm。（B′）肌球蛋白IIA和人类核抗原图像的融合显示共定位。（C） 肌球蛋白IIB的免疫荧光定位显示其水平类似或低于周围皮层和白质中的水平。
图5。
图5。
在PDGF驱动的胶质瘤模型中，浸润的人脑胶质瘤细胞经历了相同的细胞体和核变形。A组和A′组显示GFP表达的人脑胶质瘤细胞（绿色）浸润周围正常大脑，A组核DAPI染色，A′组GFP染色。肌球蛋白IIA（红色，A〃）有较强的免疫染色，这三个图像合并在A‴中。棒材，10μm。B和B′分别对应于另一个浸润表达GFP的人脑胶质瘤细胞的DAPI和GFP染色。该细胞显示肌球蛋白IIB（红色，B〃）的强染色。在这两组显微照片中，白色箭头指向细胞体的焦点变形。
图6。
图6。
刮片分析中的胶质瘤迁移。（A） 通过相位对比，以每2分钟1张图像的频率对“伤口”边缘的迁移细胞成像15小时。该图显示了不同1小时间隔的前导单元格（箭头）。迁移细胞形成一个宽阔的跛足，细胞核在迁移过程中保持不变。在12小时的时间点，细胞分裂，两个子细胞继续向不同的方向迁移。棒材，20μm。（B） 滤泡抑素或Y27632浓度改变细胞形态或阻止胞质分裂，对迁移速度没有明显影响（见补充视频4）。棒材为SEM（n=6）。（C） 用RNAi抑制肌球蛋白IIA或IIB（图1C）对迁移速度没有明显影响。棒材为SEM（n=6）。
图7。
图7。
胶质瘤通过Transwell膜迁移。（A） 固定的、DAPI染色的C6-GFP细胞在接种在3μM Fluoroblok穿透器的上表面并孵育6小时后，用10μM blebbistatin或200 nM jasplakinolde处理。尽管blebbistatin不能阻止细胞通过孔挤出细胞质（绿色），DAPI染色（蓝色）缺乏证明，它确实阻止了细胞核的挤压。茉莉花素内酯可防止细胞质和细胞核的挤压。（B） 滤泡抑素抑制核跨3μm膜转运的剂量反应。数据符合双曲线等温线K（K）我=1.0±0.1μM。（C） Y27632的相应剂量-反应关系K（K）我=5.8±0.6μM。（D） siRNA抑制肌球蛋白IIA和肌球蛋白II B对U251细胞通过3-μm Transwell膜侵袭的影响。细胞向10%FBS迁移24小时后，固定并用DAPI染色。在几个20倍的放大视野中对细胞核进行计数。数据表示为每个高功率场的平均值±SD。（E） 不同Transwell孔径对肌球蛋白II需求的影响。不同浓度的布利司他丁或Y27632处理的C6-GFP细胞迁移的剂量-反应曲线。用3-μm（蓝色）或8-μm（红色）荧光输送器培养6h后，固定细胞并用DAPI染色。这组实验中3μm孔隙的数据符合双曲线剂量-反应关系K（K）我=0.7±0.1μM，与从B组数据中得出的值非常相似。Nuclei在几个20倍放大范围内进行计数。数据表示为每个高功率场的平均值±SD。
图8。
图8。
胶质瘤细胞如何在脑组织中迁移的模型。（A） 从最左边的图像开始，浸润的神经胶质瘤细胞被描述为具有显著的前导突，该前导突通常在其远端分支。在引导过程中形成膨胀（黑色箭头）。来自神经祖细胞的证据表明，中心体和相关微管（紫色）向前移动进入扩张状态（Tsai et al.，2007）。小细胞间隙产生的机械约束阻碍细胞核和细胞体的向前运动，直到细胞后部的肌动球蛋白II收缩（红色）提供必要的力，通过细胞外间隙的收缩挤压细胞核。核位置随时间变化的图表说明了由此产生的跳跃运动。（B） ●●●●。在二维表面上爬行的胶质瘤细胞以不同的方式移动，这更类似于成纤维细胞的迁移。迁移与宽瓣的形成有关，细胞核保持不变形，其向前运动是连续和不受阻碍的，如细胞核位置随时间的线性图所示。虽然肌球蛋白II参与维持细胞极性和形状，但在这种无障碍环境中，细胞运动并不需要其活性。
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  • 分子生物学细胞。19:3179.

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