Genome-wide expression profiling, in vivo DNA binding analysis, and probabilistic motif prediction reveal novel Abf1 target genes during fermentation, respiration, and sporulation in yeast

doi:10.1091/mbc.e07-12-1242

.2008年5月；19(5):2193-207.

doi:10.1091/mbc.e07-12-1242。 Epub 2008年2月27日。

基因组表达谱分析、体内DNA结合分析和概率基序预测揭示了酵母发酵、呼吸和产孢过程中新的Abf1靶基因

乌尔里希·施莱赫特¹, Ionas Erb公司, 菲利普·德莫金, 尼古拉斯·罗宾, 瓦莱里·博德, 埃里克·范·尼姆维根, 阿兰·尼古拉斯, 迈克尔·普里米格

附属公司

PMID： 18305101
预防性维修识别码：项目经理2366881
内政部： 10.1091/mbc.e07-12-1242

基因组表达谱分析、体内DNA结合分析和概率基序预测揭示了酵母发酵、呼吸和产孢过程中新的Abf1靶基因

乌尔里希·施莱赫特等。分子生物学细胞. 2008年5月.

.2008年5月；19(5):2193-207.

doi:10.1091/mbc.e07-12-1242。 Epub 2008年2月27日。

作者

乌尔里希·施莱赫特¹, 离子Erb, 菲利普·德莫金, 尼古拉斯·罗宾, 瓦莱里·博德, 埃里克·范·尼姆维根, 阿兰·尼古拉斯, 迈克尔·普里米格

附属

¹Biozentrum和瑞士生物信息学研究所，瑞士巴塞尔CH-4056。

PMID： 18305101
预防性维修识别码：项目经理2366881
内政部： 10.1091/mbc.e07-12-1242

摘要

自主复制序列结合因子1（Abf1）最初被鉴定为一种重要的DNA复制因子，后来被证明是控制芽殖酵母有丝分裂和减数分裂细胞周期进展的调控网络的组成部分。该蛋白被认为是通过与作为不同蛋白复合体一部分的靶位点的特异性相互作用来发挥其功能，但其在有丝分裂生长和减数分裂发育中的作用仅被部分了解。在这里，我们报道了一种旨在鉴定发酵、呼吸和产孢过程中表达的直接Abf1靶基因的综合方法。蛋白质靶位点的计算预测与生长和产孢细胞中的全基因组DNA结合分析相结合。结果数据与使用野生型与温度敏感等位基因的表达谱研究结果相结合。这项工作确定434个蛋白编码位点在转录上依赖于Abf1。超过60%的假定启动子区域包含计算预测的Abf1结合位点和/或在体内与Abf1相结合，将其确定为直接靶点。本研究揭示了许多以前未知的Abf1控制位点，并为该蛋白在有丝分裂生长和减数分裂发育期间的可变DNA结合模式提供了证据。

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数字

**图1。**
二倍体的生长特性*ABF1型*野生型与*abf1-1型*突变菌株。（A）所示为二倍体野生型的连续五倍稀释(*ABF1型*/*ABF1型*; 顶部），突变体(*abf1-1型*/*abf1-1型*; 中间），以及用含有*ABF1型*(*abf1-1型*/*abf1-1型*p[+]；底部），在指定温度下在YPD板上生长2天。（B）稀释度为*ABF1型*/abf1杂合或abf1/abf1纯合菌株含有*ABF1型*如图所示，转基因融合到半乳糖诱导启动子上，生长在YPD（顶部）或YPGal（底部）上。（C）二倍体野生型生长率(*ABF1型*/*ABF1型*)和突变型(*abf1-1型*/*abf1-1型*)在指示的温度下，在液体YPD中培养9小时。显示了三个独立实验的平均值。条形图表示25、30和37°C下野生型和突变菌株的差异干涉对比（DIC）和核染色（DAPI）的SD。（D）细胞形态，如图所示。（E）细胞分离缺陷的量化*abf1-1型*背景。细胞在25、30和37°C温度下培养4小时，未添加细胞（白色条）、具有单个芽的细胞（浅灰色）和多细胞体（深灰色）的百分比绘制在年-针对野生型和突变株的轴x个-轴。显示了三个独立实验的平均值。条形代表SD。

**图2。**
确定减数分裂里程碑事件*ABF1型*与*abf1-1型*菌株。（A）含有GAL的杂合或纯合abf1缺失菌株的致病菌前DNA复制的荧光激活细胞分选分析-*ABF1型*在不同的温度和指定的时间点进行施工。G1和G2细胞的DNA含量分别为2N和4N。（B）如图所示，含有一个野生型或突变等位基因的菌株的产孢特性。在所示温度下进行减数分裂I、减数分裂II和子囊形成的细胞百分比绘制在年-轴上的时间点x个-轴从0到120小时。野生型与突变型等位基因的数据按照图例中给出的颜色编码。

**图3。**
基因组抗体1体内结合试验。（A）在含有葡萄糖（YPD）或醋酸盐（YPA）的富培养基中生长的二倍体SK1菌株中，或在产孢培养基（SPII）中培养4和8小时后，发现在背景以上富集的片段的方法和文氏图摘要。（B）四个基因间区域的图形显示，包含与UAS基序（黑色垂直条）匹配的基因以及顶部（红色）和底部（蓝色）链上的相应基因。折叠富集绘制在年-如图所示，使用培养基中培养的细胞进行实验。减数分裂诱导后4h（SPII 4h）和8h（SPI 8h）分别采集孢子细胞。使用反向荧光标记（dye-swap）、非相关抗体（mock）和无抗体（输入过度输入）对在30°C的YPD中培养的细胞进行对照实验。色码表示显著富集（红色、橙色）或背景信号（蓝色、黄色）。

**图4。**
利用Affymetrix S98基因芯片鉴定有丝分裂Abf1靶基因。（A）方法概述。（B）二倍体野生型比较剖面实验的文氏图*ABF1型*与abf1-1突变株相比，在25℃与37℃（对数生长，有丝分裂）和28℃（6和10小时时间点，减数分裂）下进行比较。给出了在三种培养基中检测到的基因。（C）彩色编码条形图显示差异表达基因，其启动子结合并包含UAS基序（红色，结合+/UAS+），其启动程序结合但缺少UAS基模（绿色，结合+/UAS−），其发起程序未结合但包含UAS模序（蓝色，结合−/UAS+）以及其启动子不受约束且缺乏UAS（bound−/UAS−）。（D）在富含葡萄糖（YPD）或醋酸盐（YPA）的富培养基中确定的三个不同表达簇（C1–C3）概述。二倍体野生型(*ABF1型*/*ABF1型*，红色）和温度敏感突变菌株(*abf1-1型*/*abf1-1型*，蓝色）。在所示温度下，根据重复分析的样品绘制信号强度中值。给出了每个聚类中的基因总数。在YPD和YPA中确定的簇C1–C3的基因含量重叠但不相同。显示了属于C中列出的四类中任何一类的基因的百分比。

**图5。**
有丝分裂表达簇中的生物过程GO项富集。（A）如图顶部所示，在YPD中生长的细胞的五个簇中识别出GO术语。矩形包含粗体数字的富集基因，与观察到的和预期的特定GO项相关。显示了基因组中带有给定GO项的基因总数。顶部显示了每个簇带有GO项的基因数量。过度表示（红色）和不足表示（蓝色）的颜色编码如比例尺（左上角）所示。（B） YPA中确定的基因簇数据。

**图6。**
Abf1绑定到*CDC3*_无人机并且是形成隔膜所必需的。（A）用多克隆抗Abf1抗体和放射性抗体进行电泳迁移率抗体超移分析*CDC3*_无人机探查。游离探针（通道1）之后是YPD（通道2）培养细胞提取物中的结合活性。将免疫前血清（车道3）、Abf1（车道4，α-Abf1）和Ndt80（车道5，α-Ndt80）抗体稀释为1:30，并添加到结合反应中。未标记野生型（车道6）和突变型（车道7）的100倍摩尔过剩*HOP1公司*_无人机以及野生型（第8车道）*CDC3*_无人机添加了探针。自由探针（fp）、非特异性带（*）、Abf1/DNA（Abf1p）和Abf1/抗体/DNA（Abf1p/ab）复合物用箭头标记。（B）二倍体野生型的荧光显微分析(*ABF1/ABF1*)和突变型(*abf1-1/abf1-1*)含有绿色荧光蛋白标记的Cdc3的细胞。菌株在25和37°C的YPD中培养。细胞形态（DIC，顶部）和GFP信号（Cdc3-GFP，中部）分别以重叠视图显示（Merge，底部）。

**图7。**
减数分裂Abf1靶基因的鉴定。（A）方法概述。（B）在28°C的产孢培养基中，在基因间鉴定出五个表达簇（C1–C5）。请注意，尽管C3-C5看起来相当相似，但我们根据经验确定了五个簇，这五个簇是通过体内结合和启动子中假定靶点的存在来确定C1中最大百分比基因的数量。含有一种野生型的菌株(*ABF1型*/abf1，red）和一个突变等位基因(*abf1-1型*/abf1，蓝色）和GAL-*ABF1型*表明转基因。根据所示时间点的重复分析样本绘制信号强度中值。给出了一个簇中的总基因数。图4C中列出了属于四类中任何一类的基因的百分比。

**图8。**
基本减数分裂基因的Abf1控制。彩色编码热图显示了减数分裂基因在富（YPD和YPA）和产孢（SPII）介质中的表达水平。纯合野生型(*ABF1型*/*ABF1型*)和突变株(*abf1-1/abf1-1*)和含有一种野生型的菌株(*ABF1型*/abf1）或突变等位基因(*abf1-1型*/abf1）和GAL-*ABF1型*表明转基因。温度在热图的底部给出。点标记启动子包含预测结合位点（UAS）和/或在不同有丝分裂（YPD和YPA）和减数分裂（SPII 4h、SPII 8h）条件下与Abf1结合的基因。减数分裂和孢子形成所必需的基因以绿色显示。日志₂-转换后的表达信号强度按照比例尺中的指示进行颜色编码。

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