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.2007年3月9日；366(5):1510-22.
doi:10.1016/j.jmb.2006.12.044。 Epub 2006年12月21日。

α-突触核蛋白序列与其膜亲和力、原纤维化倾向和酵母毒性之间的关系

迈克尔·J·沃尔斯 1, 小彼得·兰斯伯里
附属公司

α-同核蛋白序列与其膜亲和力、纤维化倾向和酵母毒性的关系

迈克尔·J·沃尔斯等人。 分子生物学杂志. .

摘要

为了研究α-突触核蛋白及其在帕金森病中的作用，我们在体外和酵母中筛选了一个随机点突变体库，以无偏见的方式找到变体，从而帮助我们了解序列-表型关系。我们开发了一种快速纯化方法，使我们能够在体外筛选59个突变体，并发现两个双点突变体，相对于野生型A30P和A53Tα-突变体纤维化缓慢。对所有这些蛋白质的酵母毒性进行了测量，我们发现其与纤维化率无关，这表明纤维化对同核蛋白诱导的酵母毒性是不必要的。我们发现β-synuclein对酵母具有中等毒性，γ-synuclean无毒。帕金森病相关基因DJ-1、parkin、Pink1、UCH-L1或突触亲蛋白与突触核蛋白的共同表达不影响突触核蛋白的毒性。第二次筛选，在酵母中数千个文库克隆中，鉴定出25个无毒的α-同核蛋白序列变体。其中大多数含有脯氨酸或谷氨酸突变，导致膜结合缺陷。我们假设，酵母毒性是由突触核蛋白直接与细胞膜结合，其水平足以非特定地破坏体内平衡引起的。

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数字

图1
图1
控制α-突触核蛋白序列、两个双点突变序列变体及其单点突变衍生物的纤维化。每个条形代表八个的平均值（除了单点突变，其中n个=4）独立表达、纯化和孵育蛋白质的试验，误差条是单独的95%置信区间。单点突变体是在BseRI酶的辅助下通过亚克隆从双点突变体中创建的。（A）如方法所述，滞后时间是通过硫黄素T荧光阈值的交叉来定义的。在8个V49E/Q79R培养基中，有2个在实验期间未出现硫黄素T阳性信号。在这些情况下，最终测量的日期被用作滞后时间（32天）。因此，该变量显示的值可能被低估了。（B） 培养14天后测量的可溶性蛋白质浓度。每个非V49E/Q79R样品在8天内都发生了纤维化。对（a）或（B）的数据进行预先计划的t检验，我们能够拒绝野生型蛋白与V49E/Q79R和A29E/T92S之间的延迟时间无差异的无效假设，p值<0.01（用星号表示）。（A）的Games-Howell（方差是非恒定的；参考文献51）多重比较程序没有检测到四个衍生单点突变体与wt蛋白或A29E/T92S之间的显著差异。然而，V49E/Q79R与任何其他蛋白的比较导致了无差异假设的拒绝。将Games-Howell检验应用于（B）中的数据，得到了类似的结果，但在拒绝零假设方面更为自由。
图2
图2
从2微米质粒p426GAL1表达各种同核蛋白基因或GFP（绿色标记）的酵母菌株W303-1a的估计最大比生长速率（与加倍时间的倒数成正比）。通过酵母文库筛选分离出的所有基因都用数字标记；最初从酵母筛选中分离出的具有共同表达的wtα-synuclein的菌株的编号带有后缀“d”。所有其他的同核蛋白序列（那些没有通过酵母筛选分离出来的序列）都有描述性标签，蓝色阴影。共核蛋白基因没有GFP标记，所有共核蛋白cDNA都包含在质粒中的相同非编码核苷酸序列上下文中（wt 1-107除外，其终止密码子后的C末端核苷酸被删除）。基因列在x个-axis以降低估计的酵母毒性。每个基因都是在独立试验中研究的(n个通常约为6），独立意味着从同一转化中挑选的不同菌落开始新的试验。采用加性双向方差分析模型（synuclein基因和区块）分析通过拟合Gompertz方程获得的最大比生长率。平方点是估计的人口边际均值。在306个样本中的2个样本中，稀疏数据导致拟合接近1.0，这是不合理的高，这些异常值被设置为更合理的上限0.3，以避免干扰统计分析。误差条代表同时的Tukey-Kramer比较区间：任何两个基因的条之间没有重叠，表明在p<0.05水平上拒绝了两个基因之间没有差异的假设。两个竖线将序列分为三组：“有毒”、“中间”和“无毒”。无毒组中的每个序列对酵母的毒性明显低于有毒组中的所有序列。中间组中的序列具有重叠有毒组和无毒组某些成员的比较区间。
图3
图3
GFP标记突触核蛋白的显微镜观察。两个水平条将同核蛋白变体分为三个毒性组，如图2所示。在缺乏尿嘧啶的合成半乳糖培养基中生长48小时后拍摄照片，所有照片均以相同的激发强度和曝光时间拍摄（100×平面荧光物镜；对图像应用高斯滤波器；对所有图像的水平和伽马设置进行相同的调整）。每个绿色方框包含两个不同的代表性摄影区域，标签与手稿中其他地方使用的标签相对应。表达质粒为p426GAL1 with GFP（synuclein的最后一个氨基酸与GFP之间的连接在方法部分中进行了描述，并且α、β和γsynucleins的连接相同）；通过以下方法将突触核蛋白cDNA插入质粒在体外结扎。
图4
图4
估计最大比增长率（图2数据）与在体外对于许多联核蛋白变体（标记），联核蛋白原纤维化滞后时间（数据来自图1）。为β和γ-同核蛋白显示了向左箭头，以表明其真实（未知）滞后时间实际上大于所示值；在β-突触核蛋白的情况下，真实值要大得多。
图5
图5
显示了酵母定量生长研究的α-突触核蛋白序列。顶部显示了α-突触核蛋白序列的结构域划分。就在下面，显示了PD-linked突变。野生型α-突触核蛋白序列是列表中的第一个序列，其他序列按从上到下降低估计酵母毒性的顺序排列；序列被分为三个统计组，如图2和图3所示。带正负电荷的氨基酸显示为红色/蓝色，脯氨酸显示为绿色阴影。正如方法中所讨论的，由于PCR引物在末端进行了突变校正，只有8–130个氨基酸具有高度突变性。停止密码用星号表示。
图6
图6
估算的最大比生长率（数据来自图2）与膜结合水平（数据来自补充图5）的散点图。膜结合水平是指在离心分析过程中与囊泡共同沉淀的突触核蛋白的量（见方法）。补充图5中列出的47种变体中的每一种都显示了一个点（有些变体已标记）。
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