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.2006年10月；26(20):7772-82.

doi:10.1128/MCB.00468-06。 Epub 2006年9月5日。

Klf4与Oct3/4和Sox2合作激活胚胎干细胞中的Lefty1核心启动子

中谷由纪夫¹, 福井信孝, 岩松育子, Masui真嗣, 高桥嘉渡, 里卡·八木, 清义藤八木, 宫崎骏, Ryo Matoba先生, Minoru S H Ko公司, Niwa Hitoshi

附属公司

PMID： 16954384
预防性维修识别码：项目经理1636862
内政部： 10.1128/MCB.00468-06

Klf4与Oct3/4和Sox2合作激活胚胎干细胞中的Lefty1核心启动子

中谷由纪夫等。摩尔细胞生物学. 2006年10月.

.2006年10月；26(20):7772-82.

doi:10.1128/MCB.00468-06。 Epub 2006年9月5日。

作者

中谷由纪夫¹, 福井信孝, 岩松育子, Shinji Masui公司, 高桥嘉渡, 里卡·八木, 清义藤八木, 宫崎骏, Ryo Matoba先生, Minoru S H Ko公司, Niwa Hitoshi

附属

¹日本神户650-0047，中央区，Minatojima-Minamimachi 2-2-3，RIKEN发育生物学中心，多能干细胞研究实验室。

PMID： 16954384
预防性维修识别码：项目经理1636862
内政部： 10.1128/立方米.00468-06

摘要

尽管POU转录因子Oct3/4在维持胚胎干细胞的自我更新中起关键作用，但其分子机制尚不清楚。我们之前报道过Oct3/4的N末端反式激活域是激活Lefty1表达所必需的（H.Niwa、S.Masui、I.Chambers、A.G.Smith和J.Miyazaki，Mol.Cell.Biol.22:1526-15362002）。这里我们测试Lefty1是否是10月3/4日的直接目标。我们在Lefty1启动子上游发现了一个ES细胞特异性增强子，该增强子包含Oct3/4和Sox2的结合位点。然而，与其他已知的Oct3/4-Sox2-dependent增强子不同，该增强子元件在分化细胞中不能被Oct3/4和Sox2激活。通过对ES特异性转录因子的功能筛选，我们发现Krüppel样因子4（Klf4）与Oct3/4和Sox2协同激活Lefty1的表达，并且Klf4作为一种介导因子特异性结合Lefty1启动子的近端元件。DNA微阵列分析显示，一部分假定的Oct3/4靶基因可能以相同的方式进行调控。我们的发现揭示了Oct3/4在ES细胞中的一种新功能。

PubMed免责声明

数字

图1。 — 图1。
鉴定中的Oct3/4依赖性增强子左侧1基因。（A）小鼠的隔离左侧1启动子。通过PCR亚克隆了一个1379 bp的基因组DNA片段，相对于转录起始位点从−1297到+82。第1章，第1染色体。（B） Oct3/4依赖的启动子活性pLefty1-luc（左侧1-luc）在ES细胞中。将报告质粒转染到ZHBTc4 ES细胞，然后进行有或无Tc的培养。显示了产生的荧光素酶活性的比率（−Tc/+Tc）。（C和D）Oct3/4依赖的缺失突变体活性pLefty1-luc（左侧1-luc）（E和F）含有假定的Oct-Sox结合位点的元素的增强活性。小缺失突变体（E）和pLefty1-luc（左侧1-luc）在ZHBTc4 ES细胞（F）中检测Oct或Sox元件（F）的突变。（G） Oct-Sox元素的EMSA。如图所示，野生型（wt）Oct-Sox元素与ES核提取物孵育，有或没有多余的冷竞争物（1到7道），或与Oct3/4、Sox2或Gata4抗体孵育（8到10道），并接受EMSA。探针的顺序如表1所示。请注意，每个抗体都获得了超移带（ss）和信号减少。

图2。 — 图2。
激活左侧1Oct3/4和Sox2启动子。（A）的活动pLefty1-luc（左侧1-luc）在由突变型Oct3/4维持的ES细胞中。的相对表达水平充足的1-luc（填充）和Fgf4tkluc公司（阴影）如图所示。Fgf4tkluc公司有一个tk公司与Oct3/4和Sox2可以结合的增强子元件连接的最小启动子。表达野生型（wt）Oct3/4的ES细胞中的荧光素酶活性设置为1.0。（B） 10月3/4日和Sox2对HeLa细胞中报告子的相对激活。报告质粒与2004年10月3日和/或Sox2系统表达载体。仅报告者的荧光素酶活性设置为1.0。（C）在10月3/4日前重新激活记者2004年10月3日-耗尽的ES细胞。报告质粒转染ZHBTc4 ES细胞，有或无2004年10月3日表达载体，并将细胞与Tc或不与Tc培养。与不含Tc和Tc的ES细胞相比，产生荧光素酶活性2004年10月3日表达式向量，如图所示。

图3。 — 图3。
激活左侧1Klf4记者。（A）激活pLefty1-luc（左侧1-luc）通过各种ES-特异性转录因子，有（开放）或无（填充）10月3/4日和Sox2系统HeLa细胞中的表达载体。荧光素酶活性的诱导是相对于空载体的诱导进行测量的。（B） Klf4在HeLa细胞中激活各种记者。报告质粒与空或Klf4公司将表达载体导入HeLa细胞，并测定其荧光素酶活性（相对于空载体）。（C）激活p左1勒克通过Klf公司家庭成员。pLefty1-luc（左侧1-luc）与空或Klf公司对HeLa细胞的家族表达载体和荧光素酶活性（相对于空载体）进行了测定。

图4。 — 图4。
Oct3/4、Sox2和Klf4在激活左侧1记者。（A）合作激活左侧110月3/4日，Sox2和Klf4报道。pLefty1-luc（左侧1-luc）与多种空，2004年10月3日,Sox2系统、和Klf4公司将表达载体导入HeLa细胞，并测量相对于空载体的荧光素酶活性。（B）激活左侧110月3/4日发布的变体。pLefty1-luc（左侧1-luc）与Oct3/4变异体、Sox2和Klf4表达载体共转染到HeLa细胞中，并相对于空载体测定荧光素酶活性。（C）激活左侧1Sox2变体的报告员。pLefty1-luc（左侧1-luc）与Sox2变异体、Oct3/4和Klf4表达载体共转染到HeLa细胞中，并测量荧光素酶活性相对于空载体的活性。（D和E）激活左侧1Klf4变体的记者。pLefty1-luc（左侧1-luc）与单独的Klf4变体（D）或Klf4变体加上Oct3/4和Sox2（E）的表达载体共转染到HeLa细胞中，并测量相对于空载体的荧光素酶活性。wt，野生型。

图5：。 — 图5：。
近端Klf4结合位点的鉴定左侧1核心启动子。（A）围绕左侧1核心启动子pLefty1ΔSacI-luc在核心启动子附近发现了两个假定的Klf4结合位点（K1和K2），这两个位点在人类中都是保守的左YB也显示了K1m和K2m的突变序列。（B）假定的Klf4结合位点对Klf4依赖活性的贡献pLefty1ΔSacI-luc。pLefty1ΔSacI-luc将K1和/或K2突变或两个位点都缺失的衍生物与Klf4或空表达载体共转染到HeLa细胞中，并测定相对于空载体的荧光素酶活性。（C）用Klf4或空表达载体转染ES或Cos-7细胞的细胞裂解液进行EMSA，包括或不包括竞争对手。所有探头如表2所示。（D） ChIP分析左侧1远端增强子、近端元件和核心启动子。设计QPCR引物检测Oct3/4和Sox2结合的远端增强子（b区）、Klf4结合的近端元件和核心启动子（d区）及其侧翼区域（a、c和e）作为对照。来自未分化（ZHBTc4 Tc−）、分化（ZHBTc4 Tc+）和Δ用所示抗体免疫沉淀N ES细胞，然后用输入DNA归一化QPCR。在每组分析中，区域a的数量设置为1.0，并计算区域b、c、d和e的相对信号强度。

图6。 — 图6。
ES细胞中的Klf4靶基因。（A）用siKlf4处理的ES细胞中干细胞标记基因的表达。通过QPCR评估用模拟转染剂（填充；设置为1.0）或siKlf4（孵化）处理的ES细胞中每个基因的相对表达水平。（B）用siKlf4处理的ES细胞的DNA微阵列分析。绘制具有相对表达水平的基因的对数比率。图为左侧1显示。（C） Klf4和Oct3/4调控的假定靶基因的鉴定。我们确定了28个基因，其表达依赖于Klf4和Oct3/4。（D）激活1200015N20瑞克Klf4启动子。1200015N20里克卢克,6Wtk-luc（重量），或tk-luc公司用空载体或Klf4表达载体共转染HeLa细胞，测定与空载体相关的荧光素酶活性。（E） 10月3/4日重新启用记者2004年10月3日-耗尽的ES细胞。报告质粒转染ZHBTc4 ES细胞2004年10月3日表达载体，细胞培养有或没有Tc，荧光素酶活性相对于没有Tc和2004年10月3日确定表达载体。

图7。 — 图7。
Klf4在激活左侧1启动子。（A） Oct3/4和Sox2激活的差异启动子因子要求。这个左侧1启动子通过招募Klf4作为启动子因子而激活，但需要Utf1号机组和10月3/4日发起人尚未确定。（B）的规定左侧1通过ES-特异性转录因子。2004年10月3日和Sox2系统被自身激活，并且Klf4公司处于Oct3/4的控制之下。

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