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.2005年3月9日；24(5):1021-32.
doi:10.1038/sj.emboj.7600570。 Epub 2005年2月3日。

FHL2通过SIRT1介导的脱乙酰化抑制FOXO1活性

杨永华 1, 侯华严, 爱德华·M·哈勒, Santo V Nicosia公司, 白文龙
附属公司

FHL2通过SIRT1介导的脱乙酰化抑制FOXO1活性

杨永华等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

叉头盒O类（FOXO）蛋白是转录因子，在PTEN抑癌基因下游发挥作用，直接控制参与凋亡、细胞周期进展和应激反应的基因表达。在本研究中，我们发现FOXO1与前列腺癌细胞中的四个半LIM 2（FHL2）相互作用。这种相互作用发生在细胞核中，并被溶血磷脂酸增强。FHL2降低FOXO1的转录活性和已知FOXO靶基因的表达，并抑制FOXO1-诱导的细胞凋亡。有趣的是，SIRT1是酵母Sir2的哺乳动物同源物，与FOXO1结合并脱乙酰，抑制其转录活性。FHL2增强了FOXO1和SIRT1的相互作用以及Sirtuin-1（SIRT1）对FOXOl的脱乙酰作用。总的来说，我们的数据显示FHL2通过促进SIRT1对FOXO1的脱乙酰化来抑制前列腺癌细胞中FOXOl的活性。

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数字

图1
图1
FHL2与FOXO1相互作用并抑制FOXOl氨基末端的转录活性。(A类)用Myc-FHL2（1μg）和Flag-FOXO1（1μg）转染DU145细胞。用兔抗Flag或抗Myc抗体免疫沉淀细胞提取物。免疫沉淀物用所示的抗Myc抗体、兔抗Flag抗体、M2抗体或山羊抗FHL2抗体进行免疫印迹。(B类)将含有5%sFBS的培养基中的DU145细胞转染Myc-FHL2（1μg）和Flag-FOXO1（1μg）。细胞用DAPI染色，并用抗FHL2和M2抗体孵育。用与Alexa Fluor 594偶联的IgG（红色，检测FHL2）或FITC（绿色，检测FOXO1）检测免疫反应性。通过反褶积显微镜的高分辨率成像观察结肠化（图B6）。(C类)用1μg His-FOXO1（1-150）转染DU145细胞，并用GST或GST-FHL2融合蛋白预结合到谷胱甘肽珠培养细胞提取物。用山羊抗FOXO1抗体免疫印迹结合到珠子和输入（沉淀用提取蛋白的50%）的蛋白质。(D类)用Gal4报告基因3×17merLuc（萤火虫，0.3μg）和pRL-null转染DU145细胞(雷尼利亚，0.01μg）和指示量的Gal4-FOXO1（1-150）和Myc-FHL2。萤火虫荧光素酶的活性标准化为雷尼利亚荧光素酶并表达为相对荧光素酶单位（RLU）。
图2
图2
FHL2通过直接DNA结合模式抑制FOXO1作用。(A类)描述FOXO1通过直接DNA结合作用的图表。(B类)用3×IRSLuc（0.3μg）、pCMVβGal（0.3μc）和指定数量的FOXO1和FHL2载体转染DU145细胞。FOXO1活性表示为标准化为β-gal活性的相对萤光素酶单位（RLU）。(C类)用Flag-FOXO1（4μg）和Myc-FHL2（4μc）转染DU145细胞。转染24小时后用抗Fas配体抗体对细胞提取物进行免疫印迹。β-肌动蛋白免疫印迹作为负荷控制。
图3
图3
FHL2抑制FOXO1诱导的细胞凋亡。(A类)如图所示，用pCMV-CD20（3μg）、Flag-FOXO1（2.5μg）和Myc-FHL2（2.5μg）转染DU145细胞。转染后16小时，通过基于FACS的分选，从CD20阴性细胞中分离出CD20阳性细胞。CD-20阳性细胞的凋亡指数按材料和方法所述进行测定。代表性配置文件显示在顶部图表中。四个独立实验的凋亡指数如下图所示。(B类)如图所示，用FOXO1（4μg）和FHL2（4μc）转染DU145细胞。如材料和方法所述，测定了capase-3的活性。
图4
图4
存在或不存在LPA时PTEN完整前列腺癌细胞核内内源性FHL2和FOXO1的相互作用。(A类)将DU145细胞在无血清培养基中饥饿36小时，并用或不用20μM LPA处理10小时。如图所示，用抗FHL2、抗FOXO1、抗Hsp60和抗PARP抗体免疫印迹细胞核和胞浆提取物。Hsp60和PARP分别是细胞溶质和核蛋白，用作亚分馏的对照。(B–D类)将DU145（B）、JCA1（C）和267B1（D）细胞饥饿并用20 mM LPA处理，如（A）所示。用兔抗FOXO1或兔抗Flag（作为对照）抗体免疫沉淀核提取物。免疫沉淀用所示的抗FHL2或山羊抗FOXO1抗体进行免疫印迹。未经免疫沉淀的抗PARP抗体免疫印迹法作为对照。
图5
图5
LPA抑制内源性FOXO1活性需要FHL2。(A类)用4μg pcDNA3（载体）或指示的siRNA载体转染DU145细胞。用抗FHL2或抗β-肌动蛋白抗体对细胞提取物进行免疫印迹。(B–D类)用3×IRSLuc（0.3μg）、pRL-null（0.01μg）和1μg所示siRNA载体转染DU145（B）、JCA1（C）和267B1（D）细胞。如图1D所示，对荧光素酶活性进行了分析和标准化。
图6
图6
FHL2抑制FOXO1活性需要SIRT1活性。(A类)用3×IRSLuc（0.3μg）和pCMVβGal（0.3μg）转染DU145细胞。如图所示，用Flag-FOXO1（0.3μg）和Myc-FHL2（0.3μc）共同转染细胞。转染细胞接受5或20mM烟酰胺24小时。测定萤光素酶活性并将其标准化为β-gal活性。通过将表达FOXO1和FHL2的细胞的归一化活性除以相应载体对照的细胞活性，计算折叠激活。(B类)用Flag-FOXO1（3μg）、Myc-FHL2（3μc）和6μg SIRT1或GFP siRNA转染DU145细胞。用抗SIRT1、抗β-actin或M2抗体对细胞提取物进行免疫印迹。(C类)用3×IRSLuc（0.3μg）、pRL-null（0.01μg）和Flag-FOXO1（0.3μg/0.6μg）所示siRNA载体转染DU145细胞。如图1D所示，对荧光素酶活性进行了分析和标准化。
图7
图7
SIRT1与FOXO1结合，并通过去乙酰化FOXOl抑制FOXO1。(A类)用HA-FOXO1（1μg）和Flag-SIRT1（1μg）转染DU145细胞。细胞提取物用兔抗-HA抗体或鼠抗-HA免疫沉淀，免疫沉淀用兔抗-HA或M2抗-HA的抗体免疫印迹。(B类)用4μg Flag-FOXO1、pcDNA-SIRT1、pcDNA A-SIRT1HY或pcDNA3转染DU145细胞，并按指示使用或不使用5 mM烟酰胺处理。用M2抗体免疫沉淀细胞提取物。免疫沉淀用抗乙酰赖氨酸抗体（上面板）或兔抗标记抗体（下面板）进行免疫印迹。(C类)用3×IRSLuc（0.3μg）、pRL-null（0.01μg）和指示量的Flag-FOXO1和pcDNA3-SIRT1转染DU145细胞。如图1D所示，对荧光素酶活性进行了分析和标准化。(D类)用3×IRSLuc（0.3μg）、pRL-null（0.01μg），Flag-FOXO1（0.3μg/）和0.3μg pcDNA3或pcDNA-SIRT1转染DU145细胞。如图所示，用或不用烟酰胺处理转基因细胞24小时。如图1D所示，对荧光素酶活性进行了分析和标准化。FOXO1活性以对照的%表示，并通过将用SIRT1转染的细胞中的活性标准化为载体对照的活性（100%）来计算。
图8
图8
FHL2通过促进FOXO1与SIRT1的相互作用降低FOXO1-乙酰化。(A类)如图所示，用Myc-FHL2（1μg）和Flag-SIRT1（1μg）转染DU145细胞。细胞提取物用抗Myc或兔抗Flag抗体免疫沉淀，免疫复合物用兔抗Flug、抗Myc、M2抗Flag或抗FHL2抗体免疫印迹。(B类)用Flag-FOXO1（0.3μg）和指示量的Myc-FHL2转染DU145细胞。对细胞提取物进行免疫沉淀，并用所示抗体进行免疫印迹。(C类)用Flag-FOXO1（3μg）、Myc-FHL2（3μg）和6μg siRNA载体转染DU145细胞。用所示抗体免疫沉淀细胞提取物。(D类)用Flag-FOXO1（3μg）、Myc-FHL2（3μg）和6μg siRNA载体转染DU145细胞。转染24小时后收集细胞，通过免疫印迹法测定Fas配体、Bim和β-肌动蛋白（负载控制）的数量。
图9
图9
FHL2抑制FOXO1作用的“系留”模式。(A类)通过“系绳”描述FOXO1行动的图表。(B类)用pGL2-CD1报告质粒（0.3μg）、pRL-null（0.01μg）和指示量的Flag-FOXO1和Myc-FHL2转染LNCaP细胞。如图1D所示，对荧光素酶活性进行了分析和标准化。(C类)用Flag-FOXO1（4μg）和4μg Myc-FHL2或pcDNA3转染DU145细胞。用抗细胞周期蛋白D1抗体通过免疫印迹法测定内源性细胞周期蛋白D1的量。β-肌动蛋白免疫印迹作为负荷控制。
图10
图10
FHL2如何通过SIRT1介导的脱乙酰化调节FOXO1活性的模型。活性FOXO1通过抑制细胞周期进展和诱导凋亡抑制前列腺肿瘤的发生。前列腺癌细胞中FOXO1的激活需要在尚未确定的位点进行乙酰化。这些位点对于其通过直接DNA结合和“系链”调节基因表达至关重要。FHL2作为连接SIRT1和FOXO1的适配器，促进前列腺肿瘤的发生，从而抑制FOXOl在前列腺细胞中的作用。
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