S6K1(-/-)/S6K2(-/-) mice exhibit perinatal lethality and rapamycin-sensitive 5'-terminal oligopyrimidine mRNA translation and reveal a mitogen-activated protein kinase-dependent S6 kinase pathway

doi:10.1128/MCB.24.8.3112-3124.2004

.2004年4月；24(8):3112-24.

doi:10.1128/MCB.24.83112-3124.2004。

S6K1（-/-）/S6K2（-/--）小鼠表现出围产期致死性和对雷帕霉素敏感的5'末端寡嘧啶mRNA翻译，并揭示了有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖的S6激酶途径

马里奥·彭德¹, 宋熙嗯, 弗吉尼亚·米尤莱, 梅勒妮贴纸, 瓦莱丽·L·戈斯, 尤尔根·梅斯坦, 马博华, 斯特凡诺·富马加里, 萨拉·科兹玛, 乔治·汤姆斯

附属公司

PMID： 15060135
预防性维修识别码： PMC381608型
内政部： 10.1128/立方米.24.8.3112-3124.2004

S6K1（-/-）/S6K2（-/--）小鼠表现出围产期致死性和对雷帕霉素敏感的5'末端寡嘧啶mRNA翻译，并揭示了有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖的S6激酶途径

马里奥·彭德等。分子细胞生物学. 2004年4月.

.2004年4月；24(8):3112-24.

doi:10.1128/MCB.24.83112-3124.2004。

作者

马里奥·彭德¹, 宋熙嗯, 弗吉尼亚·米尤莱, 梅勒妮贴纸, 瓦莱丽·L·戈斯, 尤尔根·梅斯坦, 马博华, 斯特凡诺·富马加里, 萨拉·科兹玛, 乔治·汤姆斯

附属

¹瑞士巴塞尔4058弗里德里希·米舍尔生物医学研究所。

PMID： 15060135
预防性维修识别码： PMC381608型
内政部： 10.1128/MCB.24.83112-3124.2004年

摘要

40S核糖体蛋白S6激酶（S6Ks）的激活由激素、生长因子和营养素触发的合成代谢信号介导。细菌大环内酯类雷帕霉素可抑制任何这些药物的刺激，该类雷帕霉素与哺乳动物雷帕霉素靶点（一种S6K激酶）结合并使其失活。在哺乳动物中，已鉴定出两个编码同源S6Ks的基因，即S6K1和S6K2。在这里，我们表明缺乏S6K1或S6K2的小鼠是以预期的孟德尔比率出生的。与野生型小鼠相比，S6K1（-/-）小鼠明显较小，而S6K2（-/--）小鼠往往稍大。然而，由于围产期死亡，缺乏这两种基因的小鼠的生存能力急剧下降。对来源于不同S6K基因型的细胞的细胞质和核仁中S6磷酸化的分析表明，这两种激酶都是S6完全磷酸化所必需的，但S6K2可能更普遍地参与了这种反应。尽管S6K1（-/-）/S6K2（-/--）小鼠细胞中S6磷酸化受损，但细胞周期进展和5’末端寡嘧啶mRNA的翻译仍受有丝分裂原以雷帕霉素依赖的方式调节。因此，S6K1和S6K2的缺失会严重损害动物的生存能力，但似乎不会影响这些细胞类型的增殖反应。出乎意料的是，在S6K1（-/-）/S6K2（-/-）细胞中，S6磷酸化在丝氨酸235和236处持续存在，丝氨酸235和236是响应有丝分裂原而磷酸化的前两个位点。在这些细胞中，以及雷帕霉素处理的野生型、S6K1（-/-）和S6K2（-/--）细胞中，这一步骤由丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）依赖性激酶催化，很可能是p90rsk。这些数据揭示了S6K和MAPK通路之间在介导早期S6磷酸化对有丝分裂原的反应中存在冗余。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
生成*S6K2系列*-无效等位基因。（A）老鼠*S6K2系列*基因图谱和靶向载体。矩形代表的编码外显子*S6K2系列*基因以及新霉素抗性（Neo）和胸苷激酶（TK）基因。外显子包含T环和APE序列以及起始密码子和终止密码子。同源重组事件后删除的四个外显子以灰色显示。限制位点：B、BamHI；Sp、SpeI；E、生态研究所；P、 PstI；史密斯，史密斯。（B）来自*S6K2系列*^+/−十字架。用BamHI消化尾部DNA，用Southern blotting进行分析，并与面板A中描述的探针杂交。基因组DNA的相应BamHI-片段在野生型等位基因中为9.8 kb，在目标等位基因上为8.2 kb。（C和D）S6K2纯合突变细胞中S6K2蛋白和激酶活性的缺失。（C）野生型或野生型成纤维细胞提取物的蛋白质印迹（WB）分析*S6K2系列*^−/−带有针对S6K2 N末端（N末端）区域的单克隆抗体的胚胎。S6K2的表观分子质量为68 kDa。（D）来自野生型或*S6K2系列*^−/−将胚胎饥饿过夜，然后用10%的FCS刺激30分钟，或者不治疗。用抗S6K2抗体免疫沉淀（IP）等量的蛋白质提取物，并用免疫复合物测定法测量S6K活性（见材料和方法）。

**图2。**
的表型*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−老鼠。（A）从*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^+/−在自然分娩后几分钟通过。显示了小鼠的基因型。这个*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−老鼠出生时死了，留在卵黄囊里。（B）从*S6K1系列*^+/−/*S6K2系列*^−/−剖腹产后几分钟，在胚胎期19.5天交叉。显示了小鼠的基因型。*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−小鼠更容易出现短暂的发绀症状。（C和D）纯合杂交小鼠的胎儿（C）和出生后（D）生长曲线。相同基因型小鼠的值与杂合杂交小鼠的值没有差异。数据表示每个基因型至少10只小鼠的平均值和标准偏差。wt，野生型。（E）野生型和*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−小鼠分娩后几分钟。这个*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−老鼠生来就死了。注意心肌出血。

**图3。**
S6磷酸化的调节。（A）在*S6K2系列*^−/−S6磷酸化降低，但受有丝分裂原调节，并受雷帕霉素（Rapa）抑制。用野生型和*S6K2系列*^−/−MEF公司。用10%FCS刺激细胞1小时，用或不用20 nM雷帕霉素预处理。（B） S6磷酸化*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−细胞减少程度与雷帕霉素处理的细胞相同。用野生型和*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−MEF公司。单元格按面板A所述进行处理。有关面板上A到e的解释，请参阅文本。

**图4。**
S6K活性的细胞内定位。（A）野生型免疫染色，*S6K1系列*^−/−,*S6K2系列*^−/−、和*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−含有抗磷酸化S6（Ser235/236）和抗L7a抗体的肝细胞（左面板）。右侧面板表示相同场的相位对比图像。细胞被剥夺生长因子1天，并用4nM EGF（25ng/ml）和1μM胰岛素（GF）刺激1小时，用或不用20nM雷帕霉素（R）预处理。箭头表示核仁。（B）野生型细胞核和细胞溶质提取物的免疫印迹分析，*S6K1系列*^−/−,*S6K2系列*^−/−、和*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−含有抗磷酸化S6（Ser235/236）、抗α-微管蛋白和抗CREB抗体的肝细胞。后两者分别用作细胞溶质和核标记物。

图5。 — **图5：。**
5′TOP mRNA翻译和细胞周期进展的调节在*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−MEF公司。尽管S6磷酸化对雷帕霉素治疗有抵抗力，但（A和C）5′TOP mRNA的翻译受血清和雷帕霉素（Rapa）的调节。从野生型（+/+）、，*S6K1系列*^−/−、和*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−在去除血清48小时后，用10%的血清（FCS）刺激MEF（A）或ES细胞（C），在有（空圈）或无（满圈）20 nM雷帕霉素的情况下，提取液在蔗糖梯度上离心，然后按照前面所述进行分馏（22）。用EF1α（EF-1a）mRNA特异探针对不同组分的RNA进行Northern印迹分析。每个组分中mRNA的相对含量以百分比表示。组分1至7含有多聚体，而组分8至14富含单体、核糖体亚基和mRNP。编号，编号。（B）雷帕霉素对S6K-null细胞增殖的抑制作用。野生型MEF（实心圆）和*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−MEF（空圆圈）以2×10的密度播种在24孔板中⁴每个孔的细胞数。然后用0.5%的血清处理细胞48小时，并用10%的血清刺激细胞20小时，在没有或存在雷帕霉素浓度范围为0至100 nM的情况下。细胞被标记为[^三H] 在整个刺激期内，对DNA中加入的放射性进行测量，并测定三份样品的平均值。数据表示为[^三H] 雷帕霉素处理的细胞与未处理的细胞相比掺入胸苷。

**图6。**
雷帕霉素敏感性S6K的证据。野生型蛋白质提取物的Western blot分析，*S6K1系列*^−/−,*S6K2系列*^−/−、和*S6K1系列*^−/−/*S6K2系列*^−/−用抗磷酸化S6（Ser235/236和Ser240/244）、抗磷酸化ERK1/ERK2、抗磷酸化S6K（Thr389）、抗磷酸化Rsk（Thr359和Ser363）和抗L7a抗体进行肝细胞培养，后者用作负荷对照。用4 nM EGF（25 ng/ml）和1μM胰岛素（GF）刺激细胞30分钟，用20 nM雷帕霉素（R）、1μM沃特曼宁（W）、10或30μM U0126（分别为U0 10或U0 30）和3μM PD184352（PD）预处理或不预处理。A组和C组的提取物来源于1天内不含GFs的细胞，而B组和D组的提取物则来源于2天内不含有GFs的电池。在D组中，细胞也被剥夺营养物质（所有氨基酸和葡萄糖）3小时。

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