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.2003年5月；23(10):3427-41.
doi:10.1128/MCB.23.10.3427-3441.2003。

Fli-1和GATA-1之间的蛋白相互作用通过协同DNA结合介导巨核细胞特异性基因的协同表达

迈克尔·艾斯巴赫 1, 梅丽莎·福尔摩斯, 安西亚·牛顿, 菲利普·霍格, 列文·M·哈奇吉安, 梅林克罗斯利, Beng H Chong先生
附属公司

Fli-1和GATA-1之间的蛋白相互作用通过协同DNA结合介导巨核细胞特异性基因的协同表达

迈克尔·艾斯巴赫等。 分子细胞生物学. 2003年5月.

勘误表in

  • 分子细胞生物学。2004年6月；24(11):5088

摘要

Friend leukemia integration 1（Fli-1）是转录激活因子Ets家族的成员，已被证明是巨核细胞分化过程中的重要调节因子。我们对K562 cDNA文库进行了双杂交筛选，以确定与Fli-1相互作用的转录因子，这些转录因子是巨核细胞发育的潜在调节因子。在这里，我们报道了Fli-1与GATA-1的物理相互作用，GATA-1是一种特征明确的锌指转录因子，对红系和巨核细胞分化都至关重要。我们绘制了相互作用所需的最小域，并表明GATA-1的锌指与Fli-1的Ets域相互作用。GATA-1先前已被证明与Fli-1相关蛋白PU.1的Ets结构域相互作用，这两种蛋白似乎相互抑制对方的活性。相反，我们证明GATA-1和Fli-1在瞬时转染中协同激活巨核细胞特异性启动子GPIX和GPIbalpha。使用来自包含Ets和GATA结合基序的GPIX启动子的寡核苷酸进行定量电泳迁移率变化分析，结果表明Fli-1和GATA-1表现出协同DNA结合，在Fli-1的存在下，GATA-1与DNA的结合增加了约26倍（从4.2到0.16 nM），为了测试对内源性基因的影响，我们在富含GATA-1的K562细胞中稳定地过度表达Fli-1。通过Northern blot和荧光激活细胞分选分析测定，Fli-1的过度表达诱导了内源性GPIX和GPIbalpha基因的表达。这项工作表明，Fli-1和GATA-1共同激活与巨核细胞终末分化相关的基因的表达。

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数字

图1。
图1。
Fli-1与GATA-1相互作用。（A） 将酵母菌株AH109转化为所示的质粒，并将其电镀到面板B和C中所示的相应扇形上（D）Fli-1与GATA-1的共免疫沉淀。用编码pcDNA3主干（1道）、GATA-1（2道）、Fli-1和GATA-1的cDNA转染HeLa细胞（3道）或单独转染Fli-1的cDNA（4道和5道），并用抗GATA-1单克隆抗体（1至4道）或抗Fli-1单克隆抗体作为对照（5道）进行免疫沉淀。然后用抗GATA-1或抗Fli-1单克隆抗体对免疫沉淀进行免疫印迹，如材料和方法中所述。
图2。
图2。
Fli-1-GATA-1交互所需的Fli-1域。（A） GST下拉分析中使用的Fli-1结构域的示意图。（B） Fli-1Ets结构域的氨基酸序列显示α-螺旋和β-片区域。（C） GST下拉显示与GATA-1相互作用所需的Fli-1结构域。所示GST和GST-Fli-1融合结构表达于E类.大肠杆菌菌株BL-21，使用GST-琼脂糖珠纯化，并在35标记为S的mGATA-1。在广泛清洗后，将GST-或GST-Fli-1涂层珠在加载缓冲液中煮沸并进行电泳，然后通过磷光成像显示保留的GATA-1。通道1包含10%的vitro-translated输入35S标记的GATA-1蛋白。其他车道包含GST-Fli-1删除，如图所示。
图3。
图3。
Fli-1-GATA-1交互所需的GATA域。（A） GST下拉分析中使用的GST-GATA-1结构的示意图。（B） 使用GST-GATA-1缺失和突变进行GST下拉分析，如上图所示。通道1，输入的10%为vitro-translated35S-标记Fli-1蛋白；车道2，GST涂层珠；如图所示，GST-GATA建造的3至5号车道。（C） 与Fli-1相互作用所需的GATA-1域的精细映射。车道1，33%的输入为vitro-translated35S-标记Fli-1蛋白；2号车道，消费税；泳道3，具有突变半胱氨酸C258A的GATA-C指；车道4，野生型C指；车道5至9，GATA-N指状构造，如图所示。样品按照图2图例中的描述进行培养。
图4。
图4。
Fli-1不拮抗GATA-1 DNA结合或转录活性。（A） EMSA是通过用0.2 fmol的32P-标记的GATA共识寡核苷酸5′-GATCTCCGGCAACTGATAAGATTCCCTG-3′（感觉链；Crossley等人[8]）（GATA位点以粗体显示）。第一条车道仅包含探头。通道2至17，增加GATA-1蛋白浓度（4×10−13M至4×10−8M） ●●●●。8至13车道，4×10−9M GATA-1与GST-Fli-1蛋白含量增加（8×10−12M至8×10−7M） ●●●●。通道14，GPIX-Ets探针单独（5′-ATTTCCATCACTCCCCCCGCCCGCTCCC-3′，感测链；Eisbacher等人[9]）。通道15至20，增加GST-Fli-1蛋白（8×10−12M至8×10−7M） 在有GPIX-Ets探针的情况下。（B） 将400 ng M1α报告基因单独转染HeLa细胞（bar1）或与GATA-1表达质粒一起转染HeLa细胞（bar2至4，分别为100、200和400 ng）；400 ng GATA-1与增加数量的Fli-1表达质粒结合（分别为5至7条，100、200和400 ng）；或仅增加Fli-1表达质粒的数量（分别为8至10条，100、200和400 ng）。48小时后测定生长激素水平。数值表示为每个报告者相对于数值1的平均倍数增加±标准偏差。结果显示为三次实验的平均值。（C） HeLa细胞按照B组所述进行转染，但Fli-1被PU.1取代。条状物仅相当于400 ng M1α报告物（条状物1）；仅GATA-1的表达质粒（2至4条，分别为100、200和400 ng）；GATA-1与PU.1表达质粒数量增加相结合（5至8条，分别为100、200、400和800 ng）；或仅增加PU.1表达质粒的数量（分别为9条至12条，100、200、400和800 ng）。
图5：。
图5：。
Fli-1-GATA-1组合导致HeLa细胞中巨核细胞特异性启动子GPIX和GPIbα的协同激活。（A） 将200 ng GPIX-567荧光素酶报告质粒单独转染HeLa细胞（bar1）或与增加数量的Fli-1表达质粒一起转染HeLa细胞（bar2和bar3分别为200和400 ng）或用200ng的GATA-1表达质粒与增加量的Fli-1一起转染（条4至6，分别为100、200和400ng）或仅用增加量的GATA-1表达质粒转染（条7至9，分别为200、400和800ng）。细胞转染48小时后在被动裂解缓冲液中收集，10μl用于荧光素酶分析。数值表示为每个报告人相对于值1的平均值增加±标准偏差。结果显示为三次实验的平均值。（B） 对来自a组所述单个代表性实验的30μg总细胞提取物进行Western blotting，并探测Fli-1或GATA-1的表达，以排除GATA-1表达对Fli-1水平的可能影响，反之亦然。箭头表示Fli-1和GATA-1。（C） 用800ng的GPIbα-253萤光素酶报告质粒单独转染HeLa细胞（条1）或与增加量的Fli-1表达质粒一起转染HeLa细胞（条2和3分别为100和200ng）；50 ng GATA-1表达质粒和增加的Fli-1数量（分别为4至6条，50、100和200 ng）；或仅增加GATA-1表达质粒的数量（分别为7至9条，10、20和50 ng）。按照面板A（D）的描述，在面板C的单个代表性实验的50μg总细胞提取物上采集细胞并进行分析。
图6。
图6。
Fli-1激活域和Fli-1-Ets域需要与GATA-1保持转录协同作用。（A） 单独或与GATA-1结合使用以激活GPIbα-253荧光素酶报告子的Fli-1结构的示意图。（B） HeLa细胞与800 ng GPIbα-253荧光素酶报告子和200 ng pcDNA3主干（第1道）或200 ng所示Fli-1构建物（第2至6道）共同转染，无（开放条）或（填充条）50 ng GATA-1表达质粒。通过添加pcDNA3骨架使每个样品中的总DNA保持恒定。如图5所示测量荧光素酶活性。结果表明，仅GPIbα-253报告者活动（车道1，开放酒吧）相对于值1，报告者活动的平均增加±标准偏差。结果显示为三次实验的平均值。每个实验至少进行三次，结果相似。
图7。
图7。
在保持内源性GATA-1存在的情况下，Fli-1在K562细胞中过度表达。（A） 对稳定转染对照质粒pIRES2-EGFP（第1道）或Fli-1表达质粒pIRES2-Fli-1-EGFP的K562细胞株进行Northern blot分析。每条通道包含3μg聚（A+)RNA。膜与指示的32按所示顺序标记P的cDNA探针。在每次杂交之前，在煮沸的0.1%十二烷基硫酸钠存在下剥离膜。（B） 流式细胞术分析K562-GFP和K562-Fli-1-GFP细胞系与巨核细胞终末分化相关标记物的表面表达。如图所示，在用藻红蛋白结合的二级抗体标记之前，在存在抗GPIX、抗GPIbα或抗GPIIb一级抗体的情况下培养所示细胞系。
图8。
图8。
Fli-1和GATA-1表现出协同DNA结合。（A） MBP-GATA-NC滴定量增加的平衡结合研究的EMSA32P标记的GPIX-GATA-Ets寡核苷酸（0.2 fmol/20-μl反应）。楔形图显示MBP-GATA-NC浓度增加（2×10−13M至2×10−8M） ●●●●。G.D对应于GATA-1-DNA二元复合物。DD对应于GATA-1二聚体。（B） EMSA，如面板A所述，GST-Fli-1 Ets（5×10−13M至5×10−7M） 。F.D对应于Fli-1-DNA二元复合物。（C） EMSA，如面板A所述，具有相同量的MBP-GATA-NC，并在GST-Fli-1饱和量存在的情况下进行探测。F.D对应于Fli-1-DNA复合物，G.D对应于GATA-1-DNA复合物。
图9：。
图9。
GATA-1（以G表示）或Fli-1（以F表示）与DNA（以D表示）的结合，并形成三元GATA-1-Fli-1-DNA复合物。所示为GATA-1（A）或Fli-1（B）与DNA的结合等温线，以及在固定浓度的F（C）存在下G与D的结合等温线。面板A和B中的实线表示数据与单个矩形双曲线的最佳拟合，解离常数为4.2（A）和0.94（B）nM。在面板C中，实线表示数据与平衡结合模型方程的最佳拟合，解离常数为2.3和0.16 nMK（K）GF公司和K（K）FD、G分别是。K（K）天然气和K（K）财务总监分别固定在4.2和0.94 nM。
图10。
图10。
GATA-1-Fli-1-DNA三元复合物形成的可能途径示意图。GATA-1（G）、Fli-1（F）和GPIX-GATA-Ets DNA寡核苷酸（D）之间的三元络合物可通过三种可能的途径通过中间二元络合物GATA-1-DNA、GATA-1-Fli-1或Fli-1-DNA形成。还显示了计算的离解常数。
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参考文献

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