HLF/HIF-2alpha is a key factor in retinopathy of prematurity in association with erythropoietin

doi:10.1093/emboj/cdg117

.2003年3月3日；22(5):1134-46.

doi:10.1093/emboj/cdg117。

HLF/HIF-2alpha是与促红细胞生成素相关的早产儿视网膜病变的关键因素

森田正男¹, 奥萨穆·奥内达, 山下俊郎, 佐托鲁·高桥, 铃木诺里奥, 中岛大村, 川内岛子, Masatsugu Ema公司, Shigeki Shibahara公司, 内藤忠雄（Tetsuo Udono）, Koji Tomita公司, 田井真本, Kazuhiro Sogawa先生, 山本正彦, 吉崎富井栗山

附属公司

PMID： 12606578
PMCID公司： PMC150350型
内政部： 10.1093/emboj/cdg117

HLF/HIF-2alpha是与促红细胞生成素相关的早产儿视网膜病变的关键因素

森田正信等。浮雕J. 2003.

.2003年3月3日；22(5):1134-46.

doi:10.1093/emboj/cdg117。

作者

森田正男¹, 奥萨穆·奥内达, 山下俊郎, 佐托鲁·高桥, 铃木诺里奥, 中岛修, 川内岛子, Masatsugu Ema公司, Shigeki Shibahara公司, 内藤忠雄（Tetsuo Udono）, Koji Tomita公司, 田井真本, Kazuhiro Sogawa先生, 山本正彦, 吉崎富井栗山

附属

¹东北大学科学研究生院化学系，日本仙台市青叶区青叶，邮编980-8578。

PMID： 12606578
PMCID公司： PMC150350型
内政部： 10.1093/emboj/cdg117

摘要

HLF（HIF-1alpha-like factor）/HIF-2alpha基因敲除小鼠具有胚胎致死性，阻止了对成年小鼠HLF功能的研究。为了研究HLF在成人病理性血管生成中的作用，我们通过在HLF基因的外显子1中插入夹在两个loxP序列之间的新霉素基因来产生HLF敲除（HLF（kd/kd））小鼠。野生型HLF mRNA表达减少80-20%（取决于组织）的HLF（kd/kd）小鼠具有生育能力，明显正常。作为早产儿视网膜病变（ROP）小鼠模型的高氧-常氧治疗在野生型小鼠中诱导了新生血管，但在HLF（kd/kd）小鼠中没有诱导新生血管，而高氧治疗后长时间的常氧导致HLF（kd/kd）小鼠的视网膜神经层退化，原因是血管化不良。在HLF（kd/kd）小鼠中，Cre介导的插入基因的去除恢复了HLF的正常表达和视网膜新生血管。各种血管生成因子的表达水平表明，只有促红细胞生成素（Epo）基因的表达与HLF的表达同时受到显著影响。结合HLF（kd/kd）小鼠腹腔注射Epo的结果，这表明Epo是HLF导致实验性ROP的靶基因之一。

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数字

**图1。**小鼠突变*HLF公司*基因。靶向载体轮廓和第一外显子周围的限制性图谱（封闭框）(A类). 箭头表示用于区分野生型的引物的位置*HLF公司*来自突变体的基因。MC-1-NEO（开盒）表示新霉素耐药性(*近地天体*)受MC-1启动子和TK控制的基因是受单纯疱疹病毒启动子控制的胸苷激酶基因。这个*近地天体*将夹在loxP序列之间的基因插入外显子1不是我的网站。重组ES细胞DNA的DNA印迹分析(B类)或老鼠尾巴(C类). 基因组DNA被消化速度我或生态RI，分别与5′或3′外探针杂交。基因分型*HLF公司*来自后代的基因座(D类). 用杂合子交配后代的基因组DNA进行PCR分析*HLF公司*^克朗鼠标（左侧面板）。获救人员的PCR分析*HLF公司*^液氧基因也显示（右面板）。插入的*近地天体*通过交配去除了基因*HLF公司*^克朗Cre-转基因小鼠。HLF mRNA表达的RT-PCR分析(E类). RNA是从野生型的眼睛中制备的，*HLF公司*^{千卡/千卡}和*HLF公司*^lox/lox小鼠，并进行RT-PCR分析。进行实时定量PCR（底部），野生型小鼠眼球中HLF mRNA的量指定为1.0。家蚕杂交后代同窝卵的基因分型*HLF公司*^克朗/+杂合子出生后2周(F类).

**图2。**野生型和野生型HLF表达的比较*HLF公司*^{千卡/千卡}老鼠。HLF的表达水平(A类)和HIF-1α(B类)在正常氧条件下，通过实时定量PCR检测不同器官（脑、肝、肾、心和肺）的mRNA。用抗HLF抗体对大鼠背主动脉、肾上腺和平滑肌进行免疫组织化学染色*HLF公司*^{千卡/千卡} (C类–E类)和野生型(F类–**H（H）**)E18.5小鼠。注意，HLF在*HLF公司*^{千卡/千卡}每个器官中都有野生型小鼠。条形图表示25µm（F）和100µm（G和H）。DA，背主动脉；CV，主脉；ST，交感干；AG，肾上腺；K、肾脏。

**图3。**视网膜中HLF和HIF-1α的蛋白表达及免疫组织化学染色。指出了实验的时间进程(A类). 75%O后立即取样₂处理（P12–0小时）以及从75%O转换后的2和12小时（P12-12小时）₂至正常空气。在适当的时间点（0、2和12 h）获得全细胞提取物，并进行SDS-PAGE检测HLF和HIF-1α的表达(B类). 用肌动蛋白抗体检测HLF和HIF-1α蛋白的表达，并将P12–0 h野生型小鼠中HLF和HIF-1α的表达指定为1.0(C类). 野生型（+/+）（D、E、H和I）和*HLF公司*^{千卡/千卡}小鼠（F、G、J和K）在P12–0小时或P12–12小时与抗HLF孵育(D类–**G公司**)和抗HIF-1α抗体(**H（H）**–**K（K）**)和可视化，如材料和方法中所述。神经节细胞层；ONL，外核层；INL，内核层。

**图4。**在ROP模型中治疗的不同HLF基因型小鼠视网膜新生血管。野生型（+/+）冷冻视网膜切片，*HLF公司*^{千卡/千卡}（kd/kd）和Cre重组表达*HLF公司*^{千卡/千卡}小鼠（lox/lox）在从高氧转变为正常氧后立即用PAS染色（P12–0 h）(A类–C类). 视网膜*HLF公司*^+/+,*HLF公司*^{千卡/千卡}和*HLF公司*^lox/lox小鼠在P17用苏木精染色(D类–F类). 箭头表示视网膜表面（D和F）有大量内皮细胞聚集。视网膜*HLF公司*^+/+和*HLF公司*^{千卡/千卡}在小鼠从高氧到常氧（P12–12 h）转换后的P12–0 h和12 h，用抗CD34抗体进行免疫染色(**G公司**–J). 箭头表示GCL中检测到的新生血管芽（G和H）。注意新生血管芽被拉长并渗入INL（I）。条形表示100µm。视网膜新生血管的量化*HLF公司*^+/+,*HLF公司*^{千卡/千卡}和*HLF公司*^lox/loxP17的小鼠(**K（K）**). 视网膜表面新生血管核的数量*HLF公司*^+/+,*HLF公司*^{千卡/千卡}和*HLF公司*^lox/lox对每只处理过的小鼠进行250个切片的小鼠计数，并对每个切片进行平均**P（P）* < 0.01.

**图5。**通过RT-PCR分析血管生成因子的表达。视网膜mRNA的RT-PCR分析*HLF公司*^+/+,*HLF公司*^{千卡/千卡}和*HLF公司*^lox/lox使用HLF、HIF-1α、Epo和两种形式的VEGF的特异性引物对ROP模型小鼠（P12-0小时，P12-12小时）进行研究。PCR分析结果如25所示(A类)和30个循环(B类). G3PDH被用作内部对照。HLF也进行实时定量PCR分析(C类)，HIF-1α(D类)、血管内皮生长因子(E类)和Epo(F类)视网膜内*HLF公司*^+/+和*HLF公司*^{千卡/千卡}小鼠置于ROP（C–F）模型中。相对mRNA水平*HLF公司*^+/+P12–0小时的小鼠被指定为1.0。

**图6。**抗血管生成因子抗体免疫组织化学染色。冰冻视网膜切片*HLF公司*^+/+（P12–0处的A、D、G和J，P12–12处的B、E、H、K、M、N和O）和*HLF公司*^{千卡/千卡}在ROP模型中治疗的小鼠（P12-12的C、F、I和L）用抗VEGF抗体进行免疫染色(A类–C类)，埃博(D类–F类)，第2层(**G公司**–我)，Flk-1(J–**L（左）**)和EpoR(**M（M）**–**O（运行）**). 封闭区域（M）的放大插入也显示在（O）中。箭头显示内皮管表达EpoR（M和O）。条形图表示100µm（L）和25µm（m和O）。

**图7。**Epo对视网膜新生血管形成的影响。*HLF公司*^+/+和*HLF公司*^{千卡/千卡}将小鼠保存在ROP模型中，并在给予对照PBS后检查新生血管芽的形成(A类和C类)和Epo(B类和D类)P12–24小时。显微镜下对CD34阳性新生血管芽进行评分(E类). **P（P）* < 0.01. 从高氧到常氧的转变后，野生型（EpoR+/+）小鼠(F类)和EpoR–/–：：HG1-EpoR（Tg）小鼠(**G公司**)在第17页检查。用抗CD34抗体染色后，对渗入INL的新生血管管形成的数量进行计数(**H（H）**). **P（P）* < 0.05.

**图8。**视网膜的结构和功能改变*HLF公司*^{千卡/千卡}小鼠（P21）在高氧后通过延长常氧治疗。苏木精染色视网膜*HLF公司*^+/+,*HLF公司*^kd/kd和*HLF公司*^lox/lox小鼠（P21）在高氧后长期暴露于常氧治疗(A类–C类). 视网膜的免疫组织化学染色*HLF公司*^+/+和*HLF公司*^{千卡/千卡}抗波形蛋白抗体小鼠（P21）(D类和E类). 注意，INL的损失来自*HLF公司*^{千卡/千卡}视网膜显示（B）。箭头显示视网膜中新形成的血管（D）。视网膜切片的TUNEL反应*HLF公司*^+/+,*HLF公司*^{千卡/千卡}和*HLF公司*^lox/loxP17的小鼠(F类–**H（H）**). 还提供了封闭区域的放大插页(我–**K（K）**). 视网膜切片进行TUNEL反应，然后用核固红进行复染。条形图表示100µm（H）和25µm。的ERGHLF公司^+/+和*HLF公司*^kd/kdROP模型中P21的小鼠(**L（左）**). 每个实验组使用三只动物。

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