小鼠粗线期精母细胞和圆形精母细胞转录体宽m6A甲基化的综合分析

大体形态和精子分析

从12周龄的WT和Alkbh5公司KO小鼠，清洗并浸泡在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。称重睾丸并记录其形态后，用针头多次刺穿附睾尾，然后将精子释放到37°C的PBS溶液中30分钟。使用计算机辅助精子分析（CASA）测定精子活力，并重复测量三次。用血细胞仪测量精子浓度，一式三份。

不同发育阶段生精细胞的分离

PA和RO分别取自5名成年WT和10名成年Alkbh5公司如前所述，使用STA-PUT方法对KO小鼠进行测试(Song等人，2009年). 使用显微镜检查细胞纯度和形态，混合并离心含有类似细胞类型的组分，以收集纯化的PA和RO。如前所述，通过细胞形态分析测定，PA和RO-细胞组分的纯度高于90%(Bryant等人，2013年). 上述实验重复三次。

组织学

将WT和KO小鼠的睾丸和附睾固定在4%多聚甲醛溶液中，通过乙醇和水的梯度混合物脱水，通过二甲苯清除，包埋在石蜡中，并切片至5μm厚。切片用苏木精-伊红（HE）溶液染色。最后，使用光学显微镜获得显微照片（德国莱卡DM 2000）。

Western Blot分析

使用RIPA裂解缓冲液从WT和KO小鼠的整个睾丸中提取总蛋白裂解物。采用Pierce BCA蛋白检测试剂盒（P0012，Beyotime）测定蛋白质浓度。蛋白质裂解物（30μg）再次悬浮在十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后转移到硝化纤维素膜上。用5%浓度的脱脂牛奶封闭膜，并在20°C下培养1小时。接下来，在4°C下将膜与抗Alkbh5（1:500，HPA007196；Sigma）和抗β-微管蛋白（1:3000，ab108342；Abcam）抗体孵育过夜，第二天在PBS-T中洗涤，在20°C下与山羊抗兔HRP（1:5000，ab205718；Abcam）孵育1小时。最终使用奥德赛红外成像系统（Li-Cor Biosciences）对蛋白质进行可视化。

定量实时PCR分析

使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从WT和KO小鼠的睾丸组织中提取总RNA。使用HiScriptⅡ第一链cDNA合成试剂盒（Vazyme Biotech Co.，Ltd）逆转录总共1μg的总RNA。根据制造商的说明，使用TB Green™Premix Ex Taq™II（日本京都TakaRa生物技术公司）进行实时PCR。基因的所有引物均由Genewiz合成，如图所示补充表S1mRNA的相对丰度使用2^-ΔΔCt方法并归一化为β-actin mRNA水平。

MeRIP测序和RNA测序

在低温研磨环境中，使用研磨珠和高速往复振动装置（Tissuelyser-24）分离组织样品，并使用TRIzol™试剂（目录号15596018；Invitrogen）从三组PA和RO中分离总RNA。用DNase I（M0303S；NEB）处理分离的RNA以去除基因组DNA污染。提取的RNA在−30°C的糖原（最终25μg/ml）和异丙醇中沉淀2小时。将颗粒用70%乙醇冲洗两次，干燥，并溶解在超纯水中，然后将RNA片段化。简单地说，添加2μl 10×RNA片段缓冲液（100 mM Tris-HCl，100 mM ZnCl2于无核水中），并在70°C下培养6分钟后立即添加2μl 0.5 M EDTA以终止反应(Zeng等人，2018年). 使用Zymo RNA Clean and Concentrator-5 Kit（目录号R1013；Zymo Research）纯化并回收片段RNA。一部分纯化的片段RNA被保存为输入控制。将其余纯化片段RNA与2μg抗m6A抗体（ABE572；Sigma-Aldrich）在含有Dynabeads蛋白A（10002D；Invitrogen）和Dynabheads蛋白g（10004D；Invit罗gen）的IP反应系统中孵育，在4°C下过夜，轻轻摇晃。磁珠分离后，去除上清液，添加×5沉淀缓冲液和RNA酶抑制剂。反应在4°C下进行1-3小时，然后用低盐沉淀缓冲液进行2-3次洗涤，用高盐缓冲液进行2-3次洗涤。此后，将Dynabeads置于50°C的洗脱缓冲液（200μl）中30分钟，以分离出m6A-抗体免疫沉淀RNA片段。通过酚氯仿提取和乙醇沉淀纯化mRNA。通过核糖体RNA去除产物，根据SMART协议合成第一链cDNA，并通过PCR扩增富集片段以构建cDNA文库。用DNA纯化磁珠文库片段，提取甲基化m6A超微量RNA，检测文库。使用生物QseP70分析仪检查文库，并确定文库的大小分布是否符合理论大小。最后，在NovaSeq高通量测序平台上执行PE150测序模式。

粗线期精细胞（PA）和圆形精细胞（RO）中m6A甲基化图概述

我们对PA和RO中不同阶段的生精细胞进行了MeRIP-seq分析Alkbh5公司-KO和WT小鼠(Meng等人，2013年).Alkbh5公司-KO-PA有1929个甲基化峰显著上调，326个下调峰（|log2FC|>1和FDR<0.05）。这个Alkbh5公司-与WT RO相比，KO RO有1589个甲基化峰值显著上调，而1602个甲基化峰下调(图2A、B)建议击倒Alkbh5公司可能对PA中甲基化的上调有相当大的影响，而下调的甲基化峰的数量远小于PA中上调的峰的数量。然而，RO结果与PA的结果不同，PA中上调甲基化峰数量与下调甲基化峰相似。PA和RO中的前10个甲基化改变峰如所示补充表S2接下来，来自两者的PA中甲基化峰值的分布Alkbh5公司-mRNA的3ʹ-UTR区域和长非编码（lnc）RNA的大部分区域的KO和WT相似(图2C). 具体来说，甲基化在Alkbh5公司-KO-PA显示出与WT-PA中的峰显著不同的模式，终止密码子（21.3%对19.7%）、起始密码子（4.7%对4.3%）、3UTR（20%对17.8%）、5UTR（1.6%对1.4%）和TSS（0.6%对0.3%）中甲基化峰的数量相对增加，编码DNA序列（CDS）显著减少（56.5%对51.8%）(图2E). 与PA相比，RO中不同区域的分布差异较大。击倒Alkbh5公司与PA相比，RO中lncRNA的分布变化更大(图2D). RO中不同区域的分布与PA相反Alkbh5公司-KO RO显示出与WT RO中的峰值显著不同的模式，CDS中甲基化峰值的数量相对增加（51.6%vs.49.7%），5ʹ-UTR（1.4%vs.1.2%），3ᭁ-UTR（21.4%vs.22%），TSS（0.4%vs.0.7%），终止密码子（21.1%vs.21.4%）和起始密码子（4.3%vs.5.1%）相对减少(图2F). 此外，GGAC基序在PA和RO的m6A位点高度富集(图2G).

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图2

火山图显示WT PA和Alkbh5-KO PA之间的差异甲基化峰（A）火山图显示WT RO和Alkbh5公司-KO反渗透（B）m6A峰最富集于mRNA终止密码子附近的编码序列和PA中lncRNA的分布（C）m6A峰最富集于mRNA终止密码子附近的编码序列和lncRNA在RO中的分布（D）.不同区域在Alkbh5公司-KO和WT PA（E）.不同区域在Alkbh5公司-KO和WT RO（F）从Alkbh5-KO PA中鉴定出的前五个富含m6A峰的共有序列基序（G）。

差异甲基化峰在精子发生相关途径中富集

为了研究m6A差异的生物学意义Alkbh5公司-对KO和WT生精细胞、GO和REACTOME通路进行差异甲基化峰分析(Ashburner等人，2000年;Draghici等人，2007年). GO分析可分为两部分：生物过程（BP）和分子功能（MF）。首先，我们检查了Alkbh5公司-KO PA和WT PA。我们发现上调和下调的甲基化峰都与共价染色质修饰和组蛋白修饰密切相关。此外，我们发现上调的甲基化峰与MAPK活性的激活有关，下调的甲基化峰与MAPK级联的负调控有关(图3A、B). 接下来，我们分析了RO与Alkbh5公司-KO和WT。我们发现Alkbh5公司RO和PA中的甲基化峰可能没有什么不同，因为一些上调和下调的甲基化峰值也与染色质修饰和组蛋白修饰有关(图3C、D). 我们进行了REACTOME通路分析，以进一步研究Alkbh5公司-KO小鼠。在比较中Alkbh5公司-KO和WT-PA，我们发现甲基化峰的上调和下调都与染色质修饰酶和染色质组织有关。此外，我们发现上调的甲基化峰与M相有关。比较Alkbh5公司-KO和WT RO，我们发现上调的甲基化峰与有丝分裂前中期更相关，下调的甲基化峰值与RHO GTPase循环更相关(补充图S3).

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图3

差异甲基化mRNA分析。上调GO富集分析（A）和下调（B）甲基化mRNA介于Alkbh5公司-上调的KO PA和WT PA.GO富集分析（C）和下调（D）甲基化mRNA介于Alkbh5公司-KO RO和WT RO。

转录组图谱概述揭示了精子发生障碍的重要机制

使用来自RNA-seq结果的数据集（MeRIP-seq输入库），我们比较了Alkbh5公司-KO与WT生精细胞。我们发现这些样本在表达水平的密度和分布上没有显著差异，这可以全面表明测序结果是可靠的(图4A). 我们使用R包DESeq2在PA中发现785个上调基因和440个下调基因（|log2FC|>1和FDR<0.05）。我们还发现RO中有564个上调基因和539个下调基因。PA和RO中前10个差异表达基因见补充表S3简而言之Alkbh5公司-KO PA远大于WT PA。然而Alkbh5公司-KO RO与WT RO相似(图4B、C). 此后，我们对Alkbh5公司-KO和WT生精细胞。GO分析可以分为两部分：BP和MF。首先，我们考虑了Alkbh5公司-从BP结果中，我们发现这些DEG与生殖过程密切相关，如精子细胞分化、精子细胞发育和生殖细胞发育。此外，上调基因与精子发生更为相关，下调基因与减数分裂周期更为相关。由此可以推测，击倒Alkbh5公司可能会对小鼠的生殖功能造成损害。从MF结果中，我们发现上调基因与蛋白质二硫键异构酶活性相关，下调基因与动力蛋白轻中间链结合相关(图5A、B). 接下来，我们比较了与生殖过程密切相关的二甘醇Alkbh5公司-KO RO和WT RO。然而，我们发现上调基因与蛋白质结合更相关，下调基因与ATP酶活性更相关(图5C、D). 此外，我们筛选出DEGs，并在PA和RO中进行REACTOME富集分析。此外，我们发现上调基因与M期相关。比较Alkbh5公司-KO和WT RO，我们发现上调基因与应激反应更相关(补充图S4).

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图4

差异基因分析FPKM密度分布（A）火山图显示了Alkbh5公司-KO PA和WT PA（B）,Alkbh5公司-KO RO和WT RO（C）。

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图5

上调GO富集分析（A）和下调（B）基因介于Alkbh5公司-上调的KO PA和WT PA.GO富集分析（C）和下调（D）基因介于Alkbh5公司-KO RO和WT RO。

我们感谢中国医学科学院基础医学研究所的牛亚梅博士对杂合子的慷慨捐赠Alkbh5公司老鼠。我们要感谢Home对研究人员的支持(www.home-for-researchers.com)用于书面写作。我们还要感谢Editage(编辑网www.editage.cn)用于英语编辑。