HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events

doi:10.1016/j.cell.2015.08.011

.2015年9月10日；162(6):1299-308.

doi:10.1016/j.cell.2015.08.011。 Epub 2015年8月27日。

HNRNPA2B1是m（6）a依赖性核RNA加工事件的介导者

克劳迪奥·阿拉孔¹, 哈尼·古达尔齐¹, 李贤成¹, 刘旭航¹, 赛义德·塔瓦佐伊², Sohail F Tavazoie公司^三

附属公司

¹美国纽约州洛克菲勒大学系统癌症生物学实验室，邮编：10065。
²美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理学系和系统生物学系，邮编：NY 10032。
^三美国纽约州洛克菲勒大学系统癌症生物学实验室，邮编：10065。电子地址：stavazoie@mail.rockefeller.edu。

PMID： 26321680
预防性维修识别码：项目经理4673968
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2015.08.011

HNRNPA2B1是m（6）a依赖性核RNA加工事件的介导者

克劳迪奥·阿拉孔等。单元格. 2015.

.2015年9月10日；162(6):1299-308.

doi:10.1016/j.cell.2015.08.011。 Epub 2015年8月27日。

作者

克劳迪奥·阿拉孔¹, 哈尼·古达尔齐¹, 李惠生¹, 刘旭航¹, 赛义德·塔瓦佐伊², Sohail F Tavazoie公司^三

附属公司

¹美国纽约州洛克菲勒大学系统癌症生物学实验室，邮编：10065。
²美国纽约哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理学系和系统生物学系，邮编：NY 10032。
^三美国纽约州洛克菲勒大学系统癌症生物学实验室，邮编：10065。电子地址：stavazie@mail.rockefeller.edu。

PMID： 26321680
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内政部： 2016年10月10日/j.cell.2015.08.011

摘要

N（6）-甲基腺苷（m（6）A）是信使RNA最丰富的内部修饰。虽然转录物上m（6。我们发现RNA-binding蛋白HNRNPA2B1在体内和体外结合m（6）A-bearing RNAs，其生化足迹与m（6A）共识基序相匹配。HNRNPA2B1直接结合一组核转录物，并引发与m（6）a作者METTL3类似的选择性剪接效应。此外，HNRNPA2B1与初级miRNA转录子集中的m（6）A标记结合，与microRNA微处理器复合物蛋白DGCR8相互作用，并促进初级miRNA加工。此外，HNRNPA2B1缺失和METTL3缺失也会导致这些pri-miRNA前体的类似加工缺陷。我们建议HNRNPA2B1成为m（6）a标记的核读取器，并在一定程度上调节该标记对初级microRNA加工和选择性剪接的影响。剪纸。

PubMed免责声明

数字

**图1。HNRNPA2B1识别m⁶甲基化序列**
（A）在非发现模式下，FIRE用于评估从MDA-MB-231细胞获得的HNRNPA2B1 HITS-CLIP峰中RGAC基序相对于具有类似二核苷酸频率的随机生成序列的富集情况。图中显示了m的显著富集⁶HNRNPA2B1结合位点中的一个基序（RGAC），其中黄色表示过度表达，蓝色表示低表达。表示的大小根据底部显示的热图比例。关联的*z（z）*-分数和第页-还提供了值。（B）在HNRNPA2B1和m⁶山峰相交。显示的是输入的核RNA（蓝色），m⁶A-seq（绿色）和HNRNPA2B1 HITS-CLIP（红色）显示。橙色条表示与RGAC基序匹配的序列。（C） HNRNPA2B1足迹中RGAC基序富集的FIRE分析。与背景缺失相比，HITS-CLIP协议产生的HNRNPA2B1交联诱导缺失5nt内的序列显著丰富了RGAC基序。主题，第页-价值和*z（z）*-还显示了分数。

**图2。HNRNPA2B1和METTL3的耗竭同样影响RNA剪接**
（A–D）HNRNPA2B1和METL3缺失后注释的选择性剪接事件中差异剪接百分比（ψ）之间的相关性。在HNRNPA2B1和METTL3敲低MDA-MB-231细胞（相对于对照细胞）中分别量化注释性跳过外显子（A）、保留内含子（B）、替代第一外显子和替代最后外显子。然后使用Spearman相关性评估METTL3缺失后剪接调控的相似性（m⁶作家）和HNRNPA2B1（m⁶读者）。（E）示例生鱼片图（Katz等人，2015）显示了METTL3或HNRNPA2B1缺失的MDA-MB-231细胞中发生的协同选择性剪接变化。（F）刺身图的示例如E中所示，但使用了独立的细胞系HeLa。图中显示了每个外显子的归一化覆盖率，以及估计的ψ值（拼接百分比）。例如，在这种情况下，估计29%的转录物在对照样品中包含跳过的外显子，而METTL3和HNRNPA2B1缺失细胞的估计值分别增加到87%和74%。

**图3。HNRNPA2B1的耗尽影响miRNA的产生**
（A）热图显示，HEK293细胞中靶向HNRNPA2B1的2个独立shRNA至少影响50%的miRNAs。红色代表较高的表达水平，绿色代表较低的表达水平。（B）褶皱变化柱状图（对数₂)在miRNA表达中观察到，如（A）所示的全基因组miRNA表达谱所示。显示了两个独立shRNAs的平均水平与两个对照组的平均水平之比。这个第页-指出了两样本Kolmogorov-Smirnov检验的值。（C）文氏图描述了在HNRNPA2B1或METTL3缺失后减少超过50%的miRNAs的交叉。METTL3缺失时，132个miRNA下调50%以上，HNRNPA2B1缺失时，61个miRNAs下调50%以上。在两个实验中，微阵列检测到的miRNAs的范围为329。这个第页-基于超几何分布计算值。

**图4。HNRNPA2B1与m结合⁶A-甲基化pri-miRNA序列**
（A）在MDA-MB-231细胞中由HNRNPA2B1缺失调节的示例性miRNAs的qRT-PCR定量。生成表达shControl载体或靶向HNRNPA2B1的两个独立shRNAs的稳定细胞系，提取并量化总RNA。***，第页-值<1E-3；**，第页-值<1E-2；*，第页-值<5E-2。（B）当MDA-MB-231细胞中的METTL3被2个独立的shRNAs耗尽时，miRNAs表达水平的量化如（A）所示，如qRT-PCR所测。*P（P）-*值如（A）.****，第页-值<5E-4；***，第页-值<1E-3。（C）描述m序列读取覆盖率的基因组轨迹⁶A-seq（红色）和HNRNPA2B1 HITS-CLIP（绿色）在从MDA-MB-231细胞获得的示例性pri-miRNA内。上面的轨道表示IgG免疫沉淀对照样品的读数。蓝色方框表示前miRNA的位置，橙色方框表示RGAC基序的位置。图中所示序列的染色体位置显示在面板顶部。（D）显示m之间重叠的维恩图⁶受HNRNPA2B1缺失影响的miRNAs的pri-miRNA区域内的A-seq标签和HNRNPA2 B1-HITS-CLIP标签。这个第页-基于超几何分布计算值。

**图5。HNRNPA2B1调节miRNA处理并与微处理器相互作用**
（A）通过qRT-PCR测定HNRNPA2B1和METTL3缺失后（4B–C）所示miRNA的Pri-miRNA表达水平。所有实验均以生物三等分进行。***，第页-值<1E-3；**，第页-值<1E-2；*，第页-值<5E-2。（B）体内DGCR8和HNRNPA2B1之间的相互作用。HEK293细胞在内源性DGCR8抗体介导免疫沉淀前进行化学交联。免疫沉淀后，按照指示清洗样品并用RNA酶孵育。HNRNPA2B1和DGCR8的蛋白质印迹如图所示。（C）与B相同，但进行了相互免疫沉淀。在这种情况下，内源性HNRNPA2B1被免疫沉淀，并在类似条件下通过Western blot检测其与DGCR8的相互作用。（D） DGCR8-结合的pri-miRNAs的量化。在紫外线交联后对内源性DGCR8进行免疫沉淀，提取与之结合的前miRNAs并通过qRT-PCR进行定量。条形图显示了一组HNRNPA2B1靶miRNAs的qRT-PCR，其表达在HNRNPA2 B1缺失后降低。***，第页-值<5E-4；***，第页值-<1E-3。

**图6。HNRNPA2B1结合m⁶甲基化RNA**
（A） MDA-MB-231细胞内源性HNRNPA2B1的免疫沉淀。细胞在免疫沉淀前进行紫外线交联，样品用RNase-A处理或免疫沉淀后不处理。使用所示抗体进行蛋白质印迹。（B）从对照细胞或METTL3缺失细胞免疫沉淀内源性HNRNPA2B1和相关RNA。细胞在免疫沉淀前进行紫外线交联，并使用图中所示的抗体进行蛋白质印迹。

**图7。HNRNPA2B1是⁶一个标记**
HNRNPA2B1在miRNA加工中的核作用示意图。HNRNPA2B1显示为m的读取器⁶甲基化标记。模型中描述了Pri-miRNA处理。红星代表米⁶RNA上的标记；黄色代表HNRNPA2B1 RNA结合蛋白。类似的模型可以用来描述选择性剪接，其中HNRNPA2B1与⁶甲基化前mRNA将促进剪接因子的参与。

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