视网膜测定（RD）的控制果蝇属要求无眼、正弦眼、无眼、和腊肠犬，它们作为网络的组件一起工作(1,6,30,33). 这些基因在感光细胞分化之前表达，是视网膜形态发生所必需的(2,7,25,31). 此外，无眼，无眼、和腊肠犬这足以诱导视网膜命运，因为靶向性错误表达会导致非神经元组织异位形成眼球。无眼的是的成员圣像牌转录因子基因家族(9).眼正弦编码具有DNA结合活性的同源结构域基序的蛋白质(17).眼睛缺失和腊肠犬编码缺乏DNA结合基序的新型核蛋白，但被提议作为转录辅因子(2,6,25). RD基因之间的关系不能通过简单的线性途径完全概括。虽然无眼激活了眼睛缺失和眼正弦，然后似乎激活腊肠犬有证据表明RD基因之间存在广泛的交叉调节(1,6,14,30,33). 例如，腊肠的不当表达会导致异位无眼，无眼、和眼正弦表达式(6,33). 这些发现表明果蝇属RD基因作为网络的组成部分进行合作，通过调节目标基因的表达来控制细胞的命运决定。
脊椎动物同系物无眼（Pax6），无眼（Eya1到Eya3），眼正弦（Six3和硅6)，以及腊肠（Dach)在发育中的眼睛中表达出来的(三,4,10,11,15,20,21,29,31,37,41). 一些基因在眼睛发育过程中发挥作用的证据也得到了证实。中的突变第6页和PAX6导致小眼小鼠的表型和阿尼莉迪亚分别用于人类(12,13,19,31,35,36). 此外，错误表达第6页导致异位眼形成爪蟾(8). 同样，Six3合金表达错误导致硬骨鱼异位晶状体和视网膜形成梅达卡(24,28). 最后，让我们回忆起眼睛缺失和无眼的在里面果蝇属(14)，小鼠的表达埃亚1和Eya2号机组透镜上的铭牌取决于第6页(41). 这些数据表明果蝇属RD网络在脊椎动物中是保守的。然而，尚不清楚是否所有的脊椎动物同源物果蝇属RD基因在眼睛发育过程中起作用，并且这些基因是否以相同或平行的途径运行。
一种小鼠同源物腊肠，腊肠（以下简称第1天)，并对其胚胎表达模式进行了表征(4,11,15,21,25). 腊肠和Dach1序列的比较显示存在两个高度保守的序列，腊肠结构域1（DD1）和DD2(11). 腊肠N末端（包括DD1）自主激活酵母中的转录，DD2已被证明与缺失的眼睛有物理交互作用，这表明腊肠通过DD1和DD2促进的蛋白质相互作用调节基因表达(6). 的表达式分析第1天表明它在发育中的视网膜、四肢和神经系统中表达，类似于果蝇达克斯猎犬(4,11,15,25). 作为腊肠犬突变体苍蝇没有眼睛，四肢截短，大脑发育有缺陷，两者在结构和表达上有相似之处第1天和腊肠犬建议类似的角色第1天脊椎动物发育期间(22,25,26).
这里我们展示了一个第1天敲除等位基因并表征该突变对第1天表达和小鼠发育。尽管废除了野生型胚胎表达模式，但对纯合子突变眼、四肢和大脑的大体和组织学分析显示，没有发现任何畸形。出生时，纯合子突变和野生型等位基因的频率大致为孟德尔。然而，这种突变与出生后的死亡率、哺乳失败和呼吸窘迫有关，尽管额外的分析未能揭示这种表型的原因。
材料和方法
生成第1天敲除等位基因。
600磅Sma公司我-生态人类RI片段DACH公司cDNA克隆381801RG（研究遗传学）用于筛选129/SvEv基因组噬菌体文库。三个第1天基因组克隆被分离出来，并相对映射第1天cDNA序列。基因组克隆包含第一个编码外显子：5′非翻译区的218 bp、假定的翻译起始密码子、827 bp的开放阅读框和一个在小鼠之间保守的剪接位点第1天和果蝇达克斯猎犬(11). 这些序列编码氨基酸1至276，该区域包含大多数保守DD1结构域（107个氨基酸中的98个）。第1天将外显子1两侧的基因组片段亚克隆到pUSEFUL中，以组装靶向载体（Allan Bradley，贝勒医学院）。具体而言，5′重组臂（3.7-kb萨尔我-囊I片段）和3′重组臂（5.0-kb千磅我-萨尔I片段）被亚克隆到pUSEFUL侧翼PGK-Hprt公司顺序（参见图。A） ●●●●。目标向量用线性化不是I和电穿孔进入胚胎干（ES）细胞系AB2.1。由于同源替换废除了囊外显子1上游的I位点（见图。A） ，囊I-消化Hprt（小时）+/使用5′和3′探针（位于重组臂两侧，不包含在靶向载体中）通过Southern分析筛选出单纯疱疹病毒胸苷激酶阴性AB2.1菌落DNA。作为重组的结果，PGK-Hprt公司序列替换了外显子1上游的319bp，第1天外显子1和内含子1约2kb（见图。A） ●●●●。从单独的电穿孔中分离出两个独立的置换事件（ES细胞系B和G）。除了预期的替换外，还将从靶向载体衍生的其他序列插入第1天轨迹（见图。A） ●●●●。还开发了一种基于PCR的检测方法，用于检测第1天突变等位基因。引物pl（5′-ACATGCACATACGCACACTTT）和p3（5′-AAGAGGTCAAGACACATA）从野生型等位基因扩增265-bp产物，引物p3和p2（5’-AGGCCACTGTAGCGCCAA）从突变等位基因产生381-bp扩增子。这些引物的位置如图所示。答：。
第1天基因敲除策略和基因型分析。（A）第1天目标定位策略。顶行显示野生型5′第1天外显子1（白盒）和内含子1序列（细线）位于5′和3′重组臂（灰盒）两侧的区域。中间一行显示第1天设计用于同源替换的敲除结构囊I位点、外显子1和内含子1的5′部分PGK-Hprt公司序列。结果第1天突变等位基因如底线所示。基因分型引物p1、p2和p3的位置如野生型和突变等位基因图下方的箭头所示。星号下方的线表示源自靶向载体的附加序列，插入第1天与两个独立分离的同源置换事件相关的位点（材料和方法）。pBS公司，pBluescript；HSV厚度单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。（B） 尾部DNA的PCR基因型分析。图中显示了溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，含有野生型（+/+）、杂合子（+/-）和纯合子（−/-）尾部DNA的扩增产物。引物组合p1-p3检测野生型等位基因，而引物p2和p3检测突变等位基因（材料和方法）。（C） 新生小鼠的基因型分析。从151只新生小鼠（21窝）中采集尾部DNA，并通过PCR进行分析。显示了野生型（+/+）、杂合型（+/−）和纯合型（−/−）突变动物的数量和相应的百分比。出生后不到2小时，取下这些小鼠的尾巴。纯合子可能稍显不足，因为它们可能在检测前被吃掉。
有针对性地中断第1天外显子1与被废除的RNA和蛋白质表达相关。（A） 南部分析第1天轨迹。野生型（+/+）、杂合子（+/-）和纯合子（−/-）新生尾DNA用囊一、 进行凝胶电泳，并转移到尼龙膜上。过滤器与第1天外显子1探针（图。A） 清洗并暴露在胶片上。随后，将过滤器剥离并杂交到3′第1天探针（材料和方法）。（B和C）E10野生型和纯合突变胚胎的整体原位杂交。A类第1天反义核糖探针与野生型胚胎（B）中眼睛、四肢、神经管和大脑的转录物杂交，而纯合突变体（C）中未检测到这种模式(11). 该核糖探针对应于位于外显子1下游的编码序列，因此在突变等位基因中没有被删除。在颜色发育后，从动物身上取下尾巴进行PCR基因分型。（D和E）E12.5野生型和纯合突变眼切片的免疫组织化学分析。在野生型眼睛（D）中，Dach1抗体显示周边视网膜、视网膜色素上皮和正在发育的角膜中的蛋白质表达，而在纯合子突变眼（E）中，Dech1染色降低到背景水平。晶状体和表面外胚层染色是由于二级抗体的背景染色。
原位杂交。
A类第1天如前所述制备核糖探针(11). A类Dachl生态RI cDNA片段（终止密码子的氨基酸365和3′非翻译区的386 bp）被克隆到生态pBluescript KS（+）的RI站点。这些cDNA序列位于外显子1的下游，因此在达尔突变等位基因。利用T7 RNA聚合酶合成了反义核糖探针。如其他地方所述，进行了全山胚胎的原位杂交(32). 使用抗地高辛抗体（FAb片段；Boehringer Mannheim）与碱性磷酸酶和硝基蓝四氮唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸显影（Boehringer Mannheim）偶联，检测地高辛标记的组织。
免疫组织化学。
第1天编码氨基酸461至538的cDNA序列(11)被亚克隆到pGEX4T中以产生谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）–Dach1表达结构。GST-Dach1融合蛋白纯化自大肠杆菌使用谷胱甘肽-甘露糖珠并注射到兔子体内（Cocalico Biologicals，Inc.）。然后用从兔子身上分离的血清进行免疫组织化学。将胚胎在4°C的4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲盐水（PBS）中固定3小时。在PBS中多次洗涤后，胚胎在30%蔗糖-PBS中平衡，并转移到OCT包埋培养基中。将组织切片（8至10μM）在封闭溶液（1%山羊血清，0.1%Triton X-100，PBS）中培养至少30分钟，在PBS中短暂清洗，然后在4°C的封闭溶液中用1/500稀释的抗Dach1抗血清培养过夜。然后将切片在PBS中清洗数次，并在室温下与Cy3二级抗体在封闭溶液中孵育1小时。然后清洗部分，将其安装在幻灯片上，并进行可视化。
组织学。
将胚胎和组织解剖，在冷PBS中清洗，并在4°C的温度下在新鲜4%多聚甲醛-PBS中固定过夜，轻轻搅拌。对于中枢神经系统组织学，新生儿头部和颈部用10%福尔马林固定，然后用10%甲酸脱钙。组织在PBS中清洗两次30分钟，然后用PBS蒸馏dH脱水2O-乙醇（EtOH）系列。在准备石蜡包埋的过程中，脱水组织在1:1二甲苯-EtOH中清洗15分钟，在二甲苯中清洗30分钟。组织立即在二甲苯和熔融（59°C）石蜡（寄生虫组织包埋介质；牛津实验室）的1:1混合物中清洗15 min，在熔融石蜡中清洗三次2小时，然后使用活检Uni-Cassettes（Tissue-Tek）将其嵌入石蜡中。用徕卡RM2165切片机切取包埋组织，用苏木精和伊红（H&E）染色，然后贴装。
骨骼准备。
安乐死新生小鼠的皮肤和内脏被仔细切除。尸体在95%乙醇中固定过夜，然后用0.015%阿尔西安蓝–20%乙酸（Sigma）染色过夜。将样品在95%乙醇中清洗至少3小时，并转移到2%氢氧化钾中24小时，用镊子小心地取出任何剩余的软组织。骨骼在0.005%茜素红硫酸钠–1%KOH（Sigma）中染色过夜，然后在1%KOH–20%甘油中清除至少2天。随后将骨骼储存在甘油和95%乙醇的1:1混合物中并拍照。
血液分析。
使用Microtainer血清分离管（Becton Dickinson）从被斩首的新生小鼠中分离血清。这些样本取自胃中没有明显牛奶的幼犬。使用Vitros 950化学分析仪（强生公司的Ortho-Clinical Diagnostics）对样品进行处理和分析，血糖水平分析除外（见下文）。平均值和标准偏差如表所示对来自三个单独纯合子突变和杂合子新生儿的个体样本进行钠和钾的测量。为了进行这些测量，将血清（8至10μl）在尿液稀释剂中稀释1/11。在对照实验中，系列稀释度的测量结果表明，这些值与稀释因子成线性比例。对来自15个纯合子突变株和19个杂合子新生儿的两个不同混合样本进行了丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、血尿素氮、钙和甘油三酯的测量，这些样本在0.9%NaCl中稀释了1/2.5。对四个纯合子突变的两个样本和四个杂合子新生儿的三个样本进行了肌酸和磷酸盐的测量。在出生后10分钟内，使用Accu-Chek血糖仪（Roche）对5名纯合子突变体和15名杂合子新生儿进行血糖水平测量。检查新生幼崽（不到12小时）的腹部是否有乳汁。有牛奶的杂合子的甘油三酯水平比没有牛奶的杂合子高出大约两倍。
表1
杂合子和第1天纯合子生理参数，如材料和方法所述测定
| “鼠标”组 | 平均浓度±标准偏差
|
|---|
| 钾（meq/升） | 钠（meq/升） | 丙氨酸转氨酶（单位/升） | 碱性磷酸酶（单位/升） | 血尿素氮（mg/dl） | 钙（mg/dl） | 甘油三酯（mg/dl） | 肌酐（mg/dl） | 磷酸盐（mg/dl） | 葡萄糖（mg/dl） | 有牛奶的数量/没有牛奶的数量 | 平均体重（g）±SD |
|---|
| 杂合子 | 10.6 ± 0.5 | 216 ± 11 | 103 ± 8.5 | 1,921 ± 496 | 22.5 ± 2.5 | 6.0 ± 0.5 | 85 ± 10 | 1.1 ± 0.1 | 11.7 ± 1.6 | 36.2±9.7 | 36/11 | 1.32 ± 0.13 |
| 纯合子 | 10.3 ± 0.5 | 191 ± 10 | 125 ± 9.0 | 2,034 ± 542 | 24.5 ± 2.5 | 5.4 ± 0.4 | 73 ± 21 | 1.3 ± 0.0 | 12.4±0.6 | 37.2±6.5 | 1/18 | 1.29 ± 0.12 |
结果和讨论
的生成第1天突变小鼠。
利用标准同源敲除策略，我们在第1天通过替换外显子1和侧翼基因组序列PGK-Hprt公司（图。A） ●●●●。使用3′基因组探针进行Southern blot分析，以确定ES细胞系中的两个独立替换事件，并跟踪第1天小鼠品系B和G建立过程中的突变等位基因（图。A、 右侧）。与同源替换事件一致，一个外显子1特异性探针证明，通过Southern分析，纯合子突变新生儿中的外显子一被删除（图。A、 左）。与替换事件相关的是在第1天直线B和G中的轨迹（图。A） ●●●●。然而，插入的序列与显性表型无关，因为杂合子与野生型同卵双胞胎似乎无法区分。我们还开发了一种PCR检测方法，用于对胚胎、新生儿和成人进行基因分型（图。B） ●●●●。对来自21个杂交组合的151名2岁新生儿的基因型分析表明，野生型、杂合子和突变纯合子基因型的频率大致为孟德尔（图。C） ●●●●。这些结果表明，没有明显的胚胎或胎儿致死表型与第1天突变等位基因。
第1天突变胚胎的表达分析。
确定敲除突变对第1天RNA表达，进行全山原位杂交分析。将胚胎分批杂交到第1天反义核糖探针和经过显色步骤一起处理。然后对胚胎尾部DNA进行PCR分析，以比较基因型与杂交模式（图。B） ●●●●。与野生型胚胎在大脑、视网膜和发育中的肢体中表达不同第1天纯合突变体中的表达模式显著降低到背景水平。自从第1天这些实验中使用的反义核糖探针来源于外显子1下游的编码序列第1天转录物反映了基因表达的变化，可能是由于体内新生转录物的过早终止PGK-hprt公司或删除必要的监管要素。
接下来，我们使用Dach1抗血清进行免疫组化，以确定突变对蛋白质表达水平的影响。用胚胎第12.5天（E12.5）野生型和纯合子突变眼切片培养针对未被突变删除的序列编码的肽的抗血清。在野生型样本中，抗血清染色了外周视网膜内的细胞核，据报道第1天本阶段的成绩单(4). 在发育中的角膜中检测到零星的核染色与报道的第1天眼睛周围中胚层中的RNA(4). 最后，抗血清显示视网膜色素上皮细胞核染色。先前的RNA研究没有显示E12.5视网膜色素上皮中的表达，很可能是因为存在细胞质色素颗粒，可能会模糊染色检测。在纯合子突变体中，视网膜、角膜和视网膜色素上皮中的Dach1染色降低到背景水平。综合起来，数据显示野生型第1天在胚胎发生的不同阶段，在各种组织中都无法检测到RNA和蛋白质第1天突变胚胎，表明我们已经产生了一个严重的功能丧失等位基因第1天.
新生儿分析第1天突变小鼠。
对新生婴儿的观察表明，出生后死亡与第1天突变等位基因（见下文）。为了描述死亡前的表型特征，我们将分析重点放在了不常致死的小于2小时的后代上。尽管20%的新生儿是纯合子突变型（图。C） ，新生儿的外部解剖似乎与对照组同窝婴儿的外部解剖没有区别（见下文）。这也可以在以下交叉中观察到第1天129/SvEv和129/SvEv/C57BL/6J背景下的突变系B和G。此外，对野生型、杂合子和纯合子突变新生儿的体重和长度进行比较，结果显示没有差异，这与缺乏明显的发育表型一致（表和未显示的数据）。
果蝇达克斯猎犬变种苍蝇没有眼睛，四肢截短，大脑异常(22,25,26). 鉴于两者在结构和表达上的相似性果蝇达克斯猎犬和鼠标第1天，我们假设第1天突变小鼠的眼睛、肢体和/或大脑发育会出现缺陷。然而，对纯合子突变新生儿头部和四肢的外部解剖检查未能发现任何可检测到的畸形（数据未显示）。接下来，我们检查了纯合子突变体，并对照兄弟组织以找出更细微的差异。眼部切片的H&E染色显示新生纯合子突变体中存在正常的未成熟视网膜、视网膜色素上皮、晶状体、视神经、角膜和睫状缘（图。A和B）。虽然新生儿的视网膜没有完全分化，但野生型和纯合子突变型视网膜的视网膜厚度和细胞分层程度相似（图。C和D）。我们还测试了新生儿野生型和纯合子突变视网膜的Pax6表达，没有发现可检测的差异（数据未显示）。
新生儿野生型（+/+）和第1天纯合子突变（−/−）小鼠。（A和B）眼部切片的H&E染色。新生婴儿的视网膜、视神经、晶状体、视网膜色素上皮、角膜和睫状缘存在且似乎正常第1天纯合子突变眼。（C和D）H&E染色视网膜的高倍放大。第1天突变视网膜显示出与新生野生型视网膜相似的分层程度和细胞数量。（E和F）野生型和第1天变异的腿和手指是相似的。野生型和纯合子突变骨骼的（G和H）Alcian蓝-茜素红染色未显示骨或软骨形态的任何可检测差异。分离纯合子右前肢以显示肢体的结构。（I和J）H&E染色的新生脑冠状切片显示野生型和纯合子突变动物的皮层、海马和三叉神经节（箭头所示）。（K和L）高倍放大新生小鼠H&E染色的新皮质。新生儿可以看到皮质的边缘区、皮质板、亚板和中间区第1天突变体大脑。野生型和纯合突变新生动物的（M和N）肺在气道分支、肺泡间隔、间距和细胞组成方面没有任何可检测到的差异。（O和P）使用Clara细胞特异性核糖探针CC10对新生儿肺进行整体原位杂交。野生型和纯合子突变型肺中均发现排列在末端细支气管上的上皮细胞具有相似的分支模式。
对四肢的分析还表明，野生型和第1天突变的肢体和手指似乎无法区分（图。E和F）。特别是，纯合子突变肢体的前后轴、背腹轴和近轴是正常的。同样，在新生儿纯合子突变体中未检测到肢体骨骼解剖异常（图。G和H）。自第1天在发育中的手板中以软骨膜模式表达(11)，我们检查了H&E染色的新生爪子，没有发现软组织畸形的证据（数据未显示）。
作为第1天在神经系统中表达，我们通过大脑和脑干进行了连续冠状或轴向切片的组织学分析。纯合子突变体和野生型对照组之间大脑皮层、海马、皮层下灰质、脑干颅神经核、小脑和三叉神经节的比较未发现任何异常（图。I-L）。此外，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记染色显示，野生型突变体和纯合子突变体之间的中枢神经系统和颅神经神经节中的凋亡细胞数量没有差异（数据未显示）。
尽管没有第1天在早期眼睛、肢体和大脑发育过程中的表达，这些组织正常建立和模式化。有几种解释可以解释第1天突变小鼠。首先，因为第1天变种人出生后就会死亡，我们不能排除这种可能性第1天是产后发育所必需的。例如，由于视网膜祖细胞的分化在出生后持续约2周(5),第1天可能需要成熟，而不是建立神经视网膜。同样，第1天可能是出生后大脑神经发生所必需的(16). 组织特异性敲除的产生可能导致第1天致死表型，从而确定第1天神经视网膜和/或大脑的成熟。
第二种可能性是达奇同源物补偿第1天功能丧失。事实上，我们已经分离出编码一种蛋白质的小鼠cDNA序列，该蛋白质与小鸡Dach2的氨基酸同源性高于小鸡Dach 1（G.Mardon，未发表数据）(18). 也许通过制造第1天/第2天双突变小鼠的眼睛、肢体或大脑特异性功能可归因于以下脊椎动物同源物腊肠犬未来。确定脊椎动物的作用也存在类似的情况眼睛缺失(埃亚1到Eya3号机组)眼睛发育过程中的基因。尽管埃亚1敲除小鼠表现出肾脏和耳朵发育异常，未报告肉眼异常(40).Eya2号机组和Eya3号机组在眼睛发育过程中表达，使得这些基因中的任何一个都有可能补偿埃亚1功能(41).
发育表型缺失的另一个原因第1天突变体可能是我们没有创造出空等位基因。这是一种形式上的可能性，因为我们没有删除整个编码区域。然而，外显子1的缺失导致野生型的废除第1天RNA和蛋白质表达模式。此外，这种缺失去除了DD1结构域的大部分（107个氨基酸中的98个）。由于DD1在昆虫和脊椎动物之间表现出高度的保守性（78%的一致性），并且是整个蛋白质中最保守的结构域，因此DD1在多个组织中对Dach1功能不必要的可能性似乎不大可能(11).
这个第1天突变等位基因与出生后死亡有关。
杂交后代的基因型分析表明第1天突变纯合子不能存活到断奶。出生后死亡发生在第1天129/SvEv和129/SvEv/C57BL/6J背景下的突变系B和G。对2小时龄幼崽的分析表明，93%（31个中的29个）的纯合子突变体是活的（图。C） ●●●●。因此，大多数第1天突变体在这段时间和3周龄之间死亡。
为了更好地估计死亡年龄，每天对笼子进行五次分娩和死亡检查，记录两次事件发生的时间，并对死亡和断奶的动物进行基因分型。从11个杂交后代中，我们对12个野生型、42个杂合型和14个纯合突变新生儿进行了基因分型。死亡动物中，1只为野生型，3只为杂合子，14只为纯合子。14个突变体中有9个的最小年龄范围为4至16小时，最大年龄范围为16至32小时；当首次发现这些垃圾时，剩下的5只已经死亡。这些幼崽最多只有8小时大。因此第1天突变等位基因与出生后的致死性有关，纯合子突变体在出生后第一天无法存活。
在第1天我们发现，纯合子突变基因型和胃中缺乏牛奶之间有很强的相关性（表). 这种表型与哺乳失败一致，在其他基因敲除小鼠中，由于营养不良导致出生后死亡(23). 由于纯合子突变和杂合子新生幼鼠的体重相似，纯合子突变体的母体营养供应和胎儿代谢可能正常（表). 同样，纯合子突变体和杂合子出生后测定的血糖和甘油三酯水平相似（表). 这些数据表明，纯合子在出生前后的生理状态可能是正常的，但哺乳失败可能会导致致死表型。
纯合子突变基因型的第二个特征是发绀和呼吸窘迫。我们观察到10%（31个中的3个）的2小时龄纯合子是发绀的（图。C） ●●●●。其中一个突变株出现紫绀并伴有呼吸窘迫。在较老的突变体中，我们观察到这两种现象同时发生，尽管这些表型的频率尚未确定(http://www.bcm.tmc.edu/pathology/db/Mardon/). 呼吸异常的特征是张大嘴巴和过度的膈肌收缩，在一些动物中，这种收缩持续了几个小时，直到幼崽死亡。目前尚不清楚是否所有纯合子都表现出发绀和呼吸窘迫。
肺发育异常可解释青紫/呼吸窘迫表型的偏爱。例如，发现表皮生长因子受体缺乏的小鼠表现出不同程度的发绀和呼吸困难发生率，这些与肺的异常分支和肺泡隔有关(27). 为了进一步支持这一假设，第1天已在胚胎肺中胚层检测到表达（Mardon，未发表）。然而，肺部的大体和组织学分析显示肺叶形成、气道分支、肺泡间隔或细胞结构没有异常（图。M和N）。此外，野生型和纯合型突变肺的全山原位杂交显示，表面活性蛋白B和CC10、II型肺泡细胞和Clara细胞标记物的染色没有明显差异(34,38)（未显示数据和图。O和P）。对纯合子突变体膈肌的粗略检查显示，没有结构缺陷可能是呼吸行为的先决条件（数据未显示）。虽然畸形骨骼可能会限制呼吸，但我们没有发现任何骨骼异常可以解释呼吸窘迫表型（图。G和H）。
为了确定任何其他解剖或功能异常，我们检查了主要器官的畸形，并测量了非发绀新生儿的几个血液化学参数。检查第1天通过大体和组织学分析，纯合子突变心脏和主要血管未发现明显的结构缺陷（数据未显示）。同样，肝脏组织学分析和肝脏相关功能测试、丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶也未发现野生型和纯合子突变体之间存在任何显著差异（数据未显示，表).第1天肾脏中检测到表达，表明致死/发绀表型可能与无法调节电解质浓度和/或消除代谢废物有关(21). 肾脏组织学分析未发现野生型和突变型动物之间存在任何结构缺陷（数据未显示）。此外，对血清尿素氮、钙、肌酐、钾和磷酸盐的分析也没有发现任何显著差异（表). 我们观察到钠水平存在微小差异，但尚不清楚这是否足以解释第1天致死表型。最后，作为第1天在神经系统中表达，神经系统缺陷可以解释死亡、哺乳失败、发绀和呼吸窘迫(11). 脑切片的组织学分析显示，纯合子突变体和野生型对照组之间的大脑皮层、海马、皮层下灰质、脑干颅神经核、小脑和三叉神经节没有差异（图。I至L）。
在这项工作中，我们将组织学和血液分析的重点放在了无氰和无呼吸窘迫的动物身上。目前还没有确定一个单独的因子可以作为纯合致死表型的先决条件。我们的数据表明，纯合子突变体在最初的24小时内死亡，无法吸吮。溴-3a和NMDA e2受体敲除小鼠表现出相似的表型(23,39). 然而，这些突变体的吮吸受损也与三叉神经节神经元数量减少和缺乏吮吸反应有关。这与第1天表型，纯合子突变的三叉神经节似乎正常，新生儿确实有哺乳反应（数据未显示）。其他可能的原因包括幼崽被母亲排斥、信息素对母亲的反应缺陷、无法竞争食物、吞咽时的机械问题以及胃无法容纳牛奶。
虽然纯合子突变体不能吸吮，但饥饿可能不是死亡的唯一机制。特别是，观察到一些突变幼崽在其同窝伙伴未哺乳时死亡。由于突变株的葡萄糖和甘油三酯水平与未进食的室友相似，因此饥饿不太可能导致出生后不久的死亡。此外，发绀或呼吸窘迫不是饥饿的预期结果。可能存在一个或多个潜在缺陷，这些缺陷与快速变化的新生儿生理学相互作用，导致死亡时间和机制发生变化。未来，组织特异性条件突变的产生可能提供了确定哪个组织负责产后死亡的方法。这也可以作为挽救致命表型的一种方法，并确定第1天是出生后发育过程所必需的。
